Alterações estruturais e citoquímicas que precedem, acompanham e sucedem a permeabilização irreversível da membrana mitocondrial interna em células HeLa, PC-12 e COS-7 apoptóticas. estudo microscópico e por citometria de fluxo

Resumo

Não há consenso se em células HeLa apoptóticas devido à ação da estaurosporina, a liberação para o citoplasma das proteínas que residem no espaço intermembranoso mitocondrial (PEIM) precede ou não a perda da permeabilidade seletiva da membrana mitocondrial interna (MMI). Em 02/2013 observamos em HeLa expostas à estaurosporina 0,1 µM/6h mitocôndrios com ruptura da membrana externa nas etapas iniciais, intermediárias e avançadas do processo apoptótico (Figs. 14-29). Esses resultados favorecem a concepção que a liberação das PEIM é precedida pelo colapso da normalmente relativa impermeabilidade da MMI. As alterações estruturais e citoquímicas das células HeLa e COS-7 submetidas à estaurosporina (0,1, 0,5 e 1,0 µM) e das células PC-12 privadas de nutrientes e colhidas a cada hora entre 1 e 6 h (eventualmente a cada 30 minutos-Adenda p 31) pós estímulo apoptogênico serão quantificadas e cotejada. As alterações morfológicas ao microscópio eletrônico de transmissão (MET) dispostas em cinco estágios apoptótico (ea1-ea5) (ADENDA p28) desde sinais estruturais de apoptose em células sem fenótipo nuclear apoptótico até o estágio que precede a fragmentação do citoplasma (Figs. 2-13 e 14-29) serão comparadas com alterações citoquímicas anotadas ao microscópio de fluorescência e ao citômetro de fluxo. O cotejo permitirá identificar em qual dos sucessivos estágios estruturais ocorre o evento apoptótico sinalizado por uma dada reação citoquímica. Como corolários pretendemos saber em cada uma das linhagens estudadas se: 1 - A liberação do citocromo c para o citoplasma precede é concomitante ou ulterior à perda da permeabilidade seletiva da membrana mitocondrial interna; 2 -O potencial transmembranoso mitocondrial se mantem, em HeLa e COS-7 expostas à estaurosporina após saída inicial do citocromo c. Se sim, o potencial mantido é abolido na presença de oligomicina ? (ADENDA p. 21). Nesse caso, o fluxo reverso de elétrons varia com a dose de estaurosporina?; 3 - Existe correlação temporal ou dose dependente em HeLa e Cos-7 entre a saída do citocromo c e a incidência de mitocôndrios ou com ruptura da membrana mitocondrial externa (MME) e/ou com "crista remodeling" (ADENDA p27 e Fig.16); 4 - É possível caracterizar ao MET o grupo de células inicialmente a caspases-3/7 positivas e yo-pro-1 ou anexina V negativas (-); b caspases 3/7+ e yo--pro-1 ou anexina V positivas; c yo-pro-1 ou anexina V + e iodeto de propídio negativo- ; d yo-pro-1 ou anexina V positivas e IP positivo e yo-pro-1 ou anexina V negativas e IP positivo; 5 - Existem e quais são os tópicos em que o comportamento das três linhagens celulares tem analogia(s) e/ou diferenças; 6 - Se houver diferença(s) no tópico 5, quais os possíveis fatores envolvidos. As porcentagens de células nos estágios ea1 - ea5 obtidas ao MET e as porcentagens de células que começam a expressar eventos sinalizados por dada reação citoquímica no citômetro de fluxo serão cotejadas (Adenda p30). Os eventos citoquímicos-estruturais iniciais até o estágio de ativação das caspases e finais onde não existem mais células só IP positivas serão caracterizados nas amostras de 2, 3 e 4h e 4, 5 e 6 h, respectivamente. Serão ainda avaliados nas amostras estimuladas durante 6h das 3 linhagens celulares, por microscopia e citometria, os níveis de reatividade de elementos do sistema lisossômico e das espécies reativas do oxigênio (p25ADENDA)Nosso grupo está entre os poucos de Biologia Estrutural em escala global com condições de empreender estudo citoquímico multiparamétrico, que inclui monitoramento minucioso pelo microscópio eletrônico de transmissão, sobre os sucessivos estágios do processo apoptótico. Este exame estrutural é identificador inequívoco de mitocôndrios cuja membrana interna perdeu irreversivelmente sua permeabilidade seletiva. (AU)