Validação de genes de referência para real-time PCR em células osteoblásticas provenientes de medula óssea de rato

Resumo

A técnica de Real-time PCR é um dos métodos de escolha para o estudo da expressão de genes envolvidos no processo de diferenciação dos osteoblastos em função de sua reprodutibilidade e facilidade de execução. A normalização dos dados dos genes de interesse em relação a genes de referência é fundamental para minimizar possíveis diferenças advindas de variações da técnica. Os genes de referência devem apresentar expressão constante ao longo dos diversos estágios de diferenciação celular. Diante disso, o objetivo deste projeto é avaliar a expressão de 32 genes de referência em células osteoblásticas provenientes de medula óssea de rato aos 4, 7 10, 12 e 14 dias para determinar quais são os mais estáveis nesse modelo de cultura. Os dados de ciclo limiar (Ct) de todos os genes e períodos serão analisados por meio do software Expression Suit que gera um valor de score indicativo da estabilidade de expressão do gene de referência durante a diferenciação osteoblástica. Para monitorar o crescimento das culturas, será avaliada a proliferação celular aos 4, 7 e 10 dias. Para a caracterização dos genótipo e fenótipo osteoblásticos serão avaliadas a expressão gênica de Runx2, fosfatase alcalina (ALP) e osteocalcina aos 4, 7 e 10 dias, a atividade da enzima ALP aos 10 dias e a formação de matriz mineralizada aos 21 dias. Os dados obtidos serão submetidos aos testes de análise de variância ou Kruskall-Wallis, quando apropriado.