Estabelecimento de cultivo primário de células de melanoma canino visando testes de novos agentes antineoplásicos

Resumo

O melanoma canino é uma neoplasia altamente agressiva e metastática, inexistindo atualmente tratamentos efetivos para esta doença. O objetivo deste projeto é gerar uma linhagem in vitro de melanoma canino. Para tanto, fragmento de melanoma bucal canino será colhido, as células serão dissociadas e inseridas em garrafa de cultura contendo meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 200U/mL de penicilina, 200¼g/mL de estreptomicina e 50¼g/mL de anfotericina B. O tecido tumoral fragmentado será incubado em estufa umidificada com atmosfera contendo 5% de CO‚ a 37ºC. As células se desprenderam gradualmente dos fragmentos do tecido formando uma monocamada na garrafa de cultivo. O crescimento das células neoplásicas será quantificado às 24, 48 e 72 horas por meio do MTT. Após o processamento inicial do tumor, as células serão mantidas em cultura, permitindo a saída das células do fragmento tumoral para a garrafa de cultivo. As células serão acompanhadas periodicamente para avaliação do crescimento celular e verificação de possíveis contaminações. Chegando a uma confluência de 90% as células serão dividas em mais garrafas para a expansão das mesmas. Para tanto, as células serão tripsinizadas com tripsina - EDTA 0,05% (Gibco) por 10 minutos a 37ºC. Após o desprendimento das células da garrafa a tripsina será inativada com meio de cultivo contendo soro fetal bovino. A suspensão celular será centrifugada a 1500 rpm por 5 minutos. O sobrenadante será descartado e as células ressuspendidas em meio novo e dividida em novas garrafas. O congelamento das células será realizado com uma mistura de 90% de soro fetal bovino e 10% de dimetilsulfoxóxido (DMSO) e estas células serão mantidas em nitrogênio líquido ou freezer -80ºC. As células do melanoma serão caracterizadas por meio de imunoistoquímica. Espera-se desta forma obter linhagem de melanoma canino, permitindo seu posterior uso para testes de novos agentes antineoplásicos.