Validação da PCR em tempo real associada a sequenciamento genético para detecção e caracterização de espécies e genótipos de Cryptosporidium em amostras fecais de aves e de mamíferos

Resumo

Protozoários do gênero Cryptosporidium pertencem ao filo Apicomplexa, classe Gregarinomorphea, apresentam localização epicelular, no epitélio de mucosas, particularmente do trato gastrintestinal e, ocasionalmente, infectam também os tratos respiratório, biliar e urinário, causando doença clínica e subclínica em vertebrados, sendo que algumas espécies zoonóticas. Para detecção molecular de Cryptosporidium spp. em amostras fecais, na maioria das situações é necessária a realização da PCR reação em duas etapas (nested PCR), seguida de sequenciamento genético, que é a técnica mais utilizada e permite a classificação de todas as espécies e genótipos de Cryptosporidium. No entanto, está é uma técnica que utiliza duas etapas de amplificação, o que demanda tempo, maior gasto de reagentes e, ainda, há maior possibilidade de contaminação em decorrência da utilização de material da primeira amplificação para realização da nested PCR. A PCR em tempo real é um método alternativo à PCR convencional, e proporciona um diagnóstico mais rápido, a diminuição de possíveis contaminantes no laboratório, não é necessária a realização de eletroforese para visualização do resultado, há possibilidade de visualização de resultados preliminares antes do término da reação e é possível determinar o grau de infecção, a partir da quantificação absoluta do DNA amplificado, em comparação com uma curva padrão. Serão realizados testes com diferentes protocolos PCR em tempo real: reação em uma etapa em um tubo, reação em duas etapas (nested) em um tubo e reação em duas etapas (nested) em dois tubos, para amplificação de fragmento parcial do gene da subunidade 18S do rRNA e do SsoFast Eva Green Supermix, seguida da análise da temperatura de dissociação. A validação da reação será constituída pelas etapas determinação da viabilidade, padronização, determinação da sensibilidade e especificidade analíticas, da sensibilidade e especificidade epidemiológicas, da repetibilidade e da reprodutibilidade da técnica, utilizando amostras de DNA extraído de amostras fecais (positivas e negativas para Cryptosporidium spp.) de diversas espécies de aves e de mamíferos. A quantificação absoluta de DNA de Cryptosporidium também será determinada em amostras fecais de galinha doméstica, cães, suínos e bovinos adicionadas com oocistos de Cryptosporidium parvum. O desenvolvimento deste projeto permitirá a validação de um novo método para detecção de Cryptosporidium spp. em amostra fecais de aves e de mamíferos, fornecendo assim uma alternativa aos métodos atualmente disponíveis para esse objetivo, com alta sensibilidade, alta especificidade, com menor custo, menor possibilidade de contaminação e de realização mais rápida. (AU)