Elucidando o efeito de modificações epigenéticas na sinalização de microRNA e risco de transformação maligna da mola hidatiforme completa

Resumo

Subprojeto 1: MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não-codificantes de fita simples com importantes funções regulatórias. Embora bem estudado no câncer, o papel dos miRNAs nas doenças pré-malignas é menos conhecido. As molas hidatiformes completas (MHC) são formas pré-malignas de doença trofoblástica gestacional (DTG) que podem progredir para neoplasia trofoblástica gestacional (NTG) em até 20% dos casos. No entanto, não há um biomarcador estabelecido que possa prever o desenvolvimento de NTG depois de MHC. Objetivos: Investigar possíveis diferenças na expressão de miRNAs entre MHC que evoluem para NTG em comparação àquelas que alcançam resolução após o procedimento cirúrgico de esvaziamento uterino. Métodos: O RNA total será extraído de tecidos frescos congelados provenientes de 49 amostras de placentas molares de MHC coletadas no momento do esvaziamento uterino. O RNA total também será extraído de duas linhas celulares de coriocarcinoma, JEG-3 e JAR, e uma linha celular de placenta normal imortalizada, 3A-subE. A expressão de miRNAs em todas as amostras serão quantificadas por sequenciamento de miRNA. Os resultados do sequenciamento serão validados através de ensaio quantitativo baseado em sonda. Os miRNAs significativamente alterados serão então submetidos a análises de predição de alvo e ontologia genética para determinar quais processos biológicos têm potencialmente sua influência. A expressão dos potenciais alvos de miRNAs será avaliada por qRT-PCR e Western blotting. A expressão dos potenciais alvos dos miRNAs será também validada por análise imunoistoquímica quantitativa em um conjunto independente de amostras de placentas molares de MHC fixadas em blocos de parafina (22 MHC com evolução para NTG e 15 com resolução espontânea). Subprojeto 2: Os mecanismos de transição da mola hidatiforme completa (MHC) para neoplasia trofoblástica gestacional (NTG) são pouco compreendidos. Um subconjunto de microRNAs, conhecido como "Tropho-miRs", é expresso pelo trofoblasto e desempenha funções na placentação. A MHC possui alta taxa de metilação anormal do DNA, que resulta na expressão aberrante de genes que flanqueiam agrupamentos (clusters) de microRNAs. Poucos estudos investigaram modificações epigenéticas (modificações no funcionamento de genes sem alterações na sequência de bases do DNA) de MHC incluindo metilação do DNA e expressão de microRNA. Objetivos: Determinar os padrões de expressão de microRNA e metilação do DNA em MHC e averiguar sua influência sobre o risco de transformação maligna. Métodos: DNA genômico de MHC benigna (resolução espontânea), de MHC pré-NTG (evolução para NTG) e de placenta normal será isolado de amostras de tecido fresco armazenadas a - 80ºC. A expressão diferencial de microRNAs será baseada em sequenciamento de microRNA previamente obtido (subprojeto 1). Validação da expressão de microRNAs será realizada por qRT-PCR. Análise de metilação de promotores de microRNA será efetuada pelo Kit Illumina Infinium Methylation EPIC e validada por PCR com DNA convertido por bissulfito. qRT-PCR e Western blotting serão utilizados para avaliar a expressão de RNA mensageiro e de proteínas, reguladas pelos microRNAs. Alterações na expressão de proteínas serão validadas por análise imunoistoquímica quantitativa em um conjunto independente de amostras de placentas de MHC fixadas em blocos de parafina. Achados de padrões de metilação do DNA e expressão de microRNA em tecido fresco de placentas normais serão comparados aos observados em tecido fresco de MHC benigna (resolução espontânea) e de MHC pré-NTG (evolução para NTG). (AU)