Engenharia metabólica e evolutiva de leveduras não-convencionais para produção de terpenóides bioativos

• Processo: 22/03052-0
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Projeto Inicial
• Data de Início da vigência: 01 de fevereiro de 2023
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2028
• Área do conhecimento: Ciências Agrárias - Ciência e Tecnologia de Alimentos - Engenharia de Alimentos
• Pesquisador responsável: Thiago Olitta Basso
• Beneficiário: Thiago Olitta Basso
• Instituição Sede: Escola Politécnica (EP). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Pesquisadores associados: Irina Borodina ; Taisa Magnani Dinamarco
• Bolsa(s) vinculada(s): 25/04277-4 - Engenharia metabólica da levedura Yarrowia lipolytica para a produção do monoterpeno geraniol, BP.DR; 23/18192-5 - Engenharia do bioprocesso de produção de geraniol por Yarrowia lipolytica recombinante, BP.MS; 23/12012-5 - Expressão de enzimas fusionadas para aumento da síntese de geraniol em Yarrowia lipolytica, BP.IC
• Assunto(s): Engenharia de bioprocessos Bioprocessos Monoterpenos Yarrowia Leveduras Terpenos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: bioprocessos | Fisiologia quantitativa | Geraniol | monoterpeno | quimiostato | Yarrowia lipolytica | Engenharia de Bioprocessos

Resumo

Geraniol é um monoterpeno usado como fragrância em diversos produtos como cremes e produtos de limpeza e que apresenta potencial como fármaco antimicrobiano e antitumoral, por exemplo. Apesar de seu mercado crescente, sua obtenção se restringe à extração de óleos essenciais por destilação fracionada ou à síntese química, processos pouco eficientes e caros. Nesse contexto, a aplicação da engenharia metabólica para a produção desse composto por microrganismos é uma alternativa promissora. Atualmente, a expressão heteróloga da enzima geraniol sintase é testada principalmente nos microrganismos Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae, em que a baixa disponibilidade do precursor acetil-CoA e a toxicidade do geraniol são os principais obstáculos para sua produção. Yarrowia lipolytica, uma levedura oleaginosa não-convencional, apresenta atributos que podem ser explorados para a produção de geraniol, possivelmente tornando-a uma hospedeira mais adequada para a sua produção heteróloga. Essas características incluem tolerância a compostos orgânicos e altos níveis de acetil-CoA citosólico, devido ao seu intenso fluxo de carbono para o metabolismo de lipídeos. Ainda, essa levedura apresenta capacidade de uso de diversas fontes de carbono, incluindo óleos e acetato, o que é notável pelo ponto de vista de estabelecimento de bioprocessos. Por essas e outras características, naturalmente esta é uma levedura que foi usada em diversos trabalhos para produção de diferentes terpenos. Ademais, um grupo de pesquisa parceiro da Dinamarca, que pode ser dito como um dos líderes na pesquisa de Y. lipolytica, desenvolveu linhagem já disponível para uso no projeto, com sete modificações genéticas visando a engenharia metabólica para a produção de monoterpenos. Assim, a presente Proposta de Projeto Inicial tem como objetivo usar essa linhagem pré-modificada para obter cepas de Y. lipolytica produtoras de geraniol e testá-las em cultivos de batelada alimentada e quimiostato. Inicialmente, será realizado experimento para evolução em frascos para obter linhagem de Y. lipolytica mais resistente a geraniol no meio. Será, então, aplicada a tecnologia de CRISPR-Cas9 para a expressão da enzima geraniol sintase (GES) sob controle de promotor semi-constitutivo hp4d, que só é ativado a partir da fase estacionária de crescimento microbiano. Dessa forma, é esperado que o efeito da toxicidade do geraniol durante o crescimento celular seja evitado, mesmo que parcialmente. Nessa etapa, serão testadas geraniol sintases originárias de três plantas distintas, a fim de se avaliar qual tem melhor produção na levedura oleaginosa. Após disso, será avaliada a expressão da enzima GES fusionada a pirofosfato de geranila (GPP) sintase, que sintetiza o precursor GPP, sob um promotor semi-consitituvo hp4d e um constitutivo TEFin. Como observado em S. cerevisiae, é esperado que a expressão das enzimas fusionadas aumente a produção de geraniol por canalizar o substrato GPP e por adicionar mais uma cópia de GES. Por fim, as linhagens evoluídas e engenheiradas serão analisadas quanto à capacidade de produção de geraniol em biorreatores. Para tal, a produção em sistema de batelada alimentada será avaliada e as condições de aeração, fontes de carbono, pH e regimes de alimentação serão otimizadas. Por fim, experimentos de evolução em laboratório serão realizados por meio de cultivos contínuos de longa duração em reatores de bancada (quimiostatos), no intuito de selecionar variantes da levedura engenheirada mais tolerantes ao geraniol. Portanto, o projeto logrará processo completo, desde construção de linhagens até otimização de cultivo e caracterização de fisiologia, integrando capacitação de alunos e técnicas atualmente relevantes nas áreas de engenharia metabólica e de bioprocessos em um tema de importância científica e socioeconômica. (AU)