Caracterização da atividade peroxidase de mioglobina na ausência e na presença da enzima proteolítica TIMET-oligopeptidase selvagem com diferentes graus de glutatiolação e mutantes em resíduos de cisteína

• Processo: 07/06230-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2008
• Data de Término da vigência: 28 de fevereiro de 2010
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Iseli Lourenço Nantes Cardoso
• Beneficiário: Juliana Conrado Ferreira
• Instituição Sede: Departamento de Bioquímica. Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Glutationa Ressonância paramagnética eletrônica Mioglobina Peroxidases Estresse oxidativo Radicais livres
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: epr | Estresse oxidativo | glutationa | Mioglobina | peroxidases | radicais livres | Peroxidases

Resumo

Uma provável influência da TIMET-oligopeptidase na razão glutationa reduzida/glutationa oxidada (GSH/GSSG) na célula e assim, no estresse oxidativo celular, sugere que esse mecanismo pode estar conjugado com um ciclo catalítico de peroxidase. Além de catalase e glutationa peroxidase, a atividade de peroxidase nas células pode ser exibida por outras hemoproteínas da família das globinas, a neuroglobina (Ngb) e citoglobina (Cygb), que também exibem múltiplas outras atividades. Considerando a similaridade estrutural de Cygb com mioglobina (Mb), neste projeto, usaremos a hemoproteína férrica de músculo para estudar a capacidade da TIMET-oligopeptidase de participar de um ciclo de peroxidase como agente redutor em um mecanismo controlado pelo seu grau de glutatiolação. Neste estudo será caracterizado o ciclo catalítico da mioglobina (Mb) na presença da enzima TIMET-oligopeptidase selvagem na sua forma nativa, após o tratamento com diferentes concentrações de GSH e na sua forma totalmente reduzida. Serão também utilizados os mutantes pontuais de TIMET-oligopeptidase contendo a substituição dos resíduos de aminoácidos cisteínas 246 e 248 por resíduos de serina. A cinética de redução de Mb-Composto II, gerado por peróxido de hidrogênio, na presença e na ausência da enzima TIMET-oligopeptidase na sua forma nativa glutatiolada e reduzida, bem como de suas formas mutantes, em concentrações equimolares de Mb, será feita por espectroscopia de absorção eletrônica. O estado de spin dos intermediários de alta valência de Mb gerados por peróxido de hidrogênio (Composto I e II) na presença e na ausência de TIMET-oligopeptidase bem como a geração de radicais livres serão caracterizados por meio da técnica de EPR. A atividade da TIMET-oligopeptidase glutatiolada, reduzida e mutantes glutatioladas antes e após a participação no ciclo catalítico, também será determinada e para tanto será utilizada a técnica de clivagem de substrato fluorescente. Futuramente, pretendemos obter Cyb recombinante e testar o ciclo catalítico com TIMET-oligopeptidase.