Caracterização Molecular das Proteínas Relacionadas à Resistência a Múltiplas Drogas (MRPs) de Cana-de-Açúcar Envolvidas no Processo de Desintoxicação de Herbicidas

• Processo: 07/07440-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2008
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2010
• Área de conhecimento: Ciências Agrárias - Agronomia - Fitotecnia
• Pesquisador responsável: Antonio Vargas de Oliveira Figueira
• Beneficiário: Paula Yuri Yamamoto
• Instituição Sede: Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA). Universidade de São Paulo (USP). Piracicaba , SP, Brasil
• Assunto(s): Genética vegetal Expressão gênica diferencial Estresse oxidativo
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Estresse oxidativo | expressão diferencial | safener | Genética vegetal

Resumo

O projeto teve como base elucidar parte do processo de desintoxicação de herbicidas em cana-de-açúcar com a caracterização molecular das MRPs (Multidrug-Resistance Related Proteins), as quais correspondem à transportadores ABC capazes de compartimentalizar xenobióticos no vacúolo. Foi proposta a identificação in silico das MRPs em cana-de-açúcar e análise filogenética, análise da expressão basal e induzida, e análise funcional por transgenia. No primeiro ano de projeto, os homólogos de MRP foram identificados em 12 clusters e cinco ESTs não agrupadas, a partir de ortólogos de arroz, milho, trigo e Arabidopsis sobre a base de dados do NCBI. Foram desenhados iniciadores e as MRPs foram analisadas sob indução de herbicidas em qPCR (PCR em tempo real). O experimento foi instalado em blocos ao acaso e três repetições com as variedades 'RB85-5113' e 'RB86-7515', sob tratamentos com ametrina e imazapic, e análise em quatro tempos de coleta (6, 12, 24 e 48 h). Foi analisada também a fitotoxicidade dos herbicidas sobre as variedades testadas em experimento com dose recomendada e três vezes a dose, delineado em blocos ao acaso, três repetições e cinco plantas na parcela, com as avaliações fisiológicas de massa fresca, altura, teor de clorofila e nota de fitotoxicidade. Neste segundo ano de bolsa vigente, foi utilizada uma segunda abordagem de identificação in silico das MRPs, utilizando a base de dados Gene Index, em que as sequências encontram-se agrupadas em TC (Tentative Consensus). Os TCs obtidos foram correspondentes às sequências-consenso anteriormente mineradas no NCBI, dando robustez aos homólogos identificados. In silico, foram identificados também homólogos de Brachypodium, sorgo e milho. Juntamente com sequências de arroz e Arabidopsis já descritas na literatura, foi desenvolvida uma análise filogenética entre as espécies para estabelecer as relações entre os genes. Para duas MRPs que apresentaram diferencial de expressão frente a herbicidas na etapa anterior, foram desenhados iniciadores por homologia para tentativa de obtenção das sequências completas dos genes. A dificuldade de amplificação, associada às complexidades da própria proteína (>4500 nt) e às técnicas subseqüentes que seriam aplicadas para a obtenção das sequências (RACE, por exemplo), poderiam comprometer o prazo do projeto de mais um ano. Tendo em vista que o mecanismo de desintoxicação de herbicidas envolve a conjugação com GST antes do transporte (MRP), como uma das principais etapas do processo, bem como o histórico e a experiência do laboratório com GSTs, propomos desenvolver a análise funcional por transgenia com as GSTs. Os homólogos de ScGSTF3 (classe Phi) e ScGSTU13 (classe Tau), descritos na literatura como planta-específicos e responsivos a herbicidas, foram amplificados e clonados em sistema ZeBaTa (pCXUN) para preparo de micropartículas de bombardeamento de cana-de-açúcar.