Dinâmica de formação de invadopódios em linhagem mamária MDA-MB-231 tratadas por peptídeos bioativos da laminina. Estudo por microscopia 4D.

• Processo: 09/06299-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2009
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 2010
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Morfologia - Histologia
• Pesquisador responsável: Ruy Gastaldoni Jaeger
• Beneficiário: Milza Oliveira de Assis
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 08/57103-8 - Dinamica de formacao de invadopodios em linhagens tumorais tratadas por peptideos bioativos da laminina. estudo por microscopia 4d, AP.R
• Assunto(s): Biologia celular Peptídeos bioativos Laminina
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Invadopodios | laminina | peptídeos bioativos | Biologia Celular

Resumo

Objetivo: Invadopódios são protrusões celulares com atividade de degradação da matriz peri-celular, com importância fundamental na invasão tumoral. Nesse projeto estudaremos por microscopia 4D a dinâmica de formação de invadopódios na linhagem tumoral MDA-MB-231 tratada por peptídeos bioativos da laminina. Já demonstramos que peptídeos da laminina, como YIGSR, SIKVAV, AG73 e C16, estão envolvidos com invasão e atividade de protease em células tumorais. O objetivo desse projeto é avaliar in vitro o papel dos peptídeos SIKVAV, AG-73 (cadeia alfa1 da laminina-111) e A3-10 (cadeia alfa3 da laminina-332) regulando formação de invadopódios em linhagem celular derivada de carcinoma de mama humano (células MDA-MB-231). Metodologia: A linhagem celular MDA-MB-231 será cultivada em meio Eagle modificado por Dulbecco suplementado por 10% de soro fetal bovino e 1% de solução antibiótica-antimicótica. Células serão tratadas pelos peptídeos anteriormente descritos ou pelos controles com seqüência embaralhada ("scrambled"), e posteriormente submetidas a ensaios de degradação de substrato (gelatina) fluorescente. Esses ensaios visam determinação in situ da atividade de invadopódios nas linhagens tumorais. Células MDA-MB-231 tratadas e controles serão fixadas após diferentes intervalos de tempo e submetidas à dupla-marcação actina e MT1-MMP. Também será feita dupla-marcação para actina e cortactina. Dessa forma, analisaremos a presença de focos de digestão da matriz (espaços escuros em fundo fluorescente), e a presenca de proteínas características de invadopódios, como MT1-MMP e cortactina. Contagem do número de focos de digestão, bem como mensuração da área dos mesmos, mostrará se determinado peptídeo da laminina induziu aumento da atividade de invadopódios, comparado aos controles. A dinâmica de formação dessas estruturas em linhagens tratadas pelos peptídeos da laminina será observada em microscopia 4D. Células tumorais tratadas e controles serão transfectadas com plasmídeos codificando diferentes proteínas fluorescentes de invadopódios, como actina "mCherry" e cortactina-GFP. Em seguida, essas células serão crescidas sobre substrato fluorescente. Secções ópticas no eixo Z serão obtidas em diferentes intervalos de tempo, para análise espacial e temporal da estruturação de invadopódios eventualmente induzidos por peptídeos da laminina.