Estabelecimento da metodologia de PTP-tag para a purificação de complexos proteicos contendo as proteínas FLB-3 e RUV-1 de Neurospora crassa

• Processo: 16/14384-3
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 2016
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2017
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Daniela Luz Ambrósio Breisch
• Beneficiário: Allan Pradelli Roldão
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Araraquara. Araraquara , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 13/24705-3 - O fungo filamentoso Neurospora crassa como um organismo modelo para a caracterização funcional de proteínas/fatores de transcrição que regulam o metabolismo de carboidratos, AP.TEM
• Assunto(s): Micro-organismos Neurospora crassa Domínios proteicos Purificação Análise funcional Espectrometria de massas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Flb-3 | Neurospora crassa | PTP-tag | Ruv-1 | TAP-tag | Bioquimica e Biologia Molecular de Microorganismos

Resumo

O fator de transcrição FlbC foi descrito, inicialmente, em A. nidulans como uma proteína reguladora do desenvolvimento assexual, desencadeando o processo de conidiação através da ativação de uma cascata de genes e, até o momento, foi pouco caracterizado do ponto de vista funcional em outros fungos filamentosos. Resultados prévios obtidos com o fungo N. crassa, mostraram que a proteína ortóloga à FlbC, denominada de FLB-3, regula o desenvolvimento sexual e assexual do fungo e também participa na regulação do metabolismo dos carboidratos de reserva glicogênio e trealose. Considerando os resultados previamente obtidos com este fator de transcrição em nosso laboratório, a investigação da interação de FLB-3 com outras proteínas será importante na caracterização funcional desta proteína. A metodologia de TAP-tag (Tandem Affinity Purification) tem sido utilizada em vários organismos para a purificação de complexos proteicos presentes em extratos, através do uso de um tag fusionado à proteína alvo. Este processo ocorre em duas etapas de purificação, o que resulta na remoção de contaminantes e concentração das proteínas presentes no complexo. As proteínas obtidas são então identificadas por espectrometria de massas. Com o intuito de estabelecer esta metodologia em nosso laboratório, este projeto propõe o uso de linhagens de N. crassa que expressem as proteínas FLB-3 e RUV-1, fusionadas ao PTP-tag (Proteína C, sítio de clivagem da TEV e Proteína A) para a purificação dos complexos nos quais estas fazem parte e identificação de seus componentes proteicos. RUV-1, uma DNA helicase, participa de diferentes complexos e também é estudada em nosso laboratório, sendo assim, esta proteína será utilizada como um controle positivo para a padronização desta técnica.