Clonagem e caracterização de prolactina do peixe Arapaima gigas (pirarucu)

• Processo: 19/07343-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2019
• Data de Término da vigência: 30 de setembro de 2020
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Animal
• Pesquisador responsável: João Ezequiel de Oliveira
• Beneficiário: Vanessa de Luna Yosidaki
• Instituição Sede: Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN). Secretaria de Desenvolvimento Econômico (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 17/26369-1 - Síntese, purificação e caracterização das gonadotrofinas de pirarucu (Arapaima gigas): ag-FSH e ag-LH, AP.R
• Assunto(s): Biotecnologia Clonagem Amplificação de genes Prolactina Pirarucu
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Arapaima gigas | clonagem | Prolactina | purificação | Biotecnologia

Resumo

A) Construção dos vetores de expressão para produção de ag-LH em células CHO e obtenção de uma linhagem estável de células produtoras. Será seguida a metodologia já padronizada no Laboratório de Hormônios do IPEN para o FSH humano (Sevilhano, 2017), mediante construção e co-transfecção dos dois vetores para a expressão da ag-GTH-± e ag-LH-². Como no caso da obtenção do ag-FSH, após a escolha dos clones mais produtivos, será realizada a amplificação gênica mediante cultivo em suspensão de células HEK 293. Será considerada útil uma produção de pelo menos 1 µg de ag-LH por ml de meio de cultura condicionado. B) Purificação de ag-LH A purificação será realizada após obtenção de aproximadamente 10 litros de meio condicionado de HEK293 produtoras de agLH. A técnica de purificação será derivada de metodologias já dominadas pelo Laboratório de Hormônios do IPEN para a purificação de TSH humano (Ribela,2003; Mendonça, 2005; Oliveira, 2007; Ventini, 2011) oportunamente modificadas. C) Caracterização do ag-LH purificado obtido. Serão realizados todos os testes físico-químicos, imunológicos e biológicos já padronizados no Laboratório de Hormônios para outras glicoproteínas hormonais e que, obviamente, deverão ser oportunamente adaptados para este hormônio nunca sintetizado antes: SDSPAGE, Western blotting, HPLC de exclusão molecular, HPLC em fase reversa, MALDI-TOF e ensaio biológico pelo incremento de peso da vesícula seminal em ratos machos (19-22 dias de idade) (Oliveira, 2003; 2008; Loureiro, 2006; Ribela,2006; Carvalho, 2009; Almeida, 2010).