Avaliação de mecanismos moleculares de resistência de Candida tropicalis em amostras de hemoculturas de 3 países da América Latina

• Processo: 20/12082-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2020
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2021
• Área de conhecimento: Ciências da Saúde - Medicina - Clínica Médica
• Pesquisador responsável: Arnaldo Lopes Colombo
• Beneficiário: Larissa Molina Favarello
• Instituição Sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 17/02203-7 - Rede multidisciplinar internacional para caracterização de aspectos microbiológicos e da história natural de Infecções Fúngicas Invasivas (IFI) por espécies do gênero Candida, AP.TEM
• Assunto(s): Candida tropicalis Candidemia Infectologia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Antifúngicos Azólicos | Candida tropicalis | Candidemia | Sucetibilidade a antifúngicos | Infectologia

Resumo

1.JustificativaNas últimas décadas, houve um aumento substancial de casos de infecções invasivas por Candida spp. em hospitais terciários de diferentes regiões do globo. Tendo em vista as altas taxas de morbidade e mortalidade associadas a estas condições, assim como a baixa sensibilidade de cultura para identificar precocemente tais pacientes, práticas de profilaxia e terapêutica empírica antifúngica tem sido cada vez mais utilizadas (1). Estas práticas terapêuticas associam-se a risco de maiores taxas de incidência de resistência de Candida a antifúngicos, em especial o incremento de ocorrência de infecções invasivas por Candida não-albicans.Vários autores tem encontrado taxas de resistência de C. tropicalis da ordem de of 2.4%-9.0% nos EUA e 1.7%-22.0% na Europa (2-7). Na China, Fan et al. (2017) estudaram 507 isolados de C. tropicalis coletados entre 2009 a 2014 e observaram taxas de 10 a 40% de isolados com susceptibilidade reduzida a fluconazol e/ou voriconazol. Na Austrália, estudo recente encontrou 25% de amostras de C. tropicalis não sensíveis a fluconazol (9).Na América Latina, ao longo dos últimos 10 anos, taxas de resistência de C. tropicalis a fluconazol tem sido descritas em frequência variando de 0.5 a 18%. Entretanto, os mecanismos moleculares de resistência tem sido documentados em pequeno número destes estudos (10, 11).Neste sentido, há necessidade de realizarmos estudos multicêntricos para caracterizar a prevalência de isolados de C. tropicalis com fenótipo de sensibilidade dose-dependente e resistência a triazólicos entre as amostras clinicas de pacientes atendidos em centros médicos da América Latina, buscando caracterizar os principais mecanismos de resistência que tem sido descritos em Candida spp:(i)Redução na concentração intracelular de fármacos pelo aumento da expressão de bombas de efluxo (12, 13, 14, 15,16)(ii)Mudanças no alvo de atuação dos triazólicos, com ênfase em mutações no gene ERG11 (15-18). (iii)Aumento na produção de 14 ±- lanosterol desmetilase (12). 2.Objetivos1.Consolidar nossa parceria com centros médicos do Brasil, Chile e Colômbia em estudos voltados para caracterização de epidemiologia de candidemia nestes países;2.Avaliar a prevalência de isolados de C. tropicalis resistentes ao fluconazole entre amostras coletadas em nossos centros colaboradores;3.Caracterizar mecanismos moleculares de resistência;3.Material e métodos3.1.Seleção de amostrasPara este temático, nós selecionamos cerca de 200 centros médicos do Brasil, Chile e Colômbia que nos encaminharam cerca de 700 amostras de Candida spp. (600 do Brasil) de episódios de candidemia. Vamos selecionar para estudos moleculares todas aquelas que apresentarem valores de CIM para Fluconazol e 2µg/mL. 3.2.Identificação de espécieAs amostras serão inicialmente triadas por MALDI-TOF MS, sendo que todas aquelas com fenótipo de resistência serão identificadas por sequenciamento da região ITS do DNAr (19). 3.3.Teste de susceptibilidade in vitro Os isolados serão avaliados quanto ao perfil de susceptibilidade de acordo com as normas do CLSI para microdiluição em caldo(20, 21).3.4.Sequenciamento do gene ERG11 Sequenciaremos o gene ERG11 utilizando o sequenciador automático ABI 3500. As sequências serão alinhadas e editadas pelos programas SeqMan II and EditSeq software packages (Lasergene v8.0; DNAStar, Madison, WI) (22).3.5.Expressão de genes relacionados a mecanismos de resistência por RT-qPCREnsaios de transcrição reversa e PCR quantitativa (RT-qPCR) serão utilizados para análsie da expressão de genes CDR, MDR1 e ERG11 de cepas de C. tropicalis antes e após exposiação a fluconazol (22). Experimentos serão realizados em triplicata.4.Questões de ética:Projeto já aprovado pela comissão de ética com carta de anuência de participação dos centros médicos.