Melhoramento da via de produção de etanol por bactérias termofílicas envolvendo a piruvato descarboxilase: desenvolvimento e triagem de bibliotecas

• Processo: 22/05802-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de junho de 2022
• Data de Término da vigência: 14 de setembro de 2022
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
• Pesquisador responsável: Daniel Groban Olson
• Beneficiário: Pamela Magalí Bermejo
• Instituição Sede: Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 18/25682-0 - Laboratório de biocombustíveis avançados de segunda geração, AP.BIOEN.SPEC
• Assunto(s): Biotecnologia Clostridium thermocellum Piruvato descarboxilase Etanol Acetobacter
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cellulosic ethanol | Clostridium thermocellum | Consolidated Bioprocessing | Library screening | Pathway improvement | Pyruvate decarboxylase | Biotecnologia

Resumo

Clostridium thermocellum é um candidato termofílico para bioprocessamento consolidado, realizando tanto a solubilização da celulose quanto a fermentação. No entanto, apesar dos esforços significativos, o título máximo de etanol alcançado até o momento permanece abaixo das metas exigidas industrialmente (90% do rendimento teórico e título de 40 g/L). Em microrganismos, a fermentação do piruvato em etanol pode ocorrer com ou sem acetil coenzima A (acetil-CoA) como intermediário. Em leveduras e Zymomonas mobilis, o piruvato é descarboxilado diretamente a acetaldeído, que é então reduzido a etanol. Em muitos outros organismos, incluindo C. thermocellum, o piruvato é oxidativamente descarboxilado a acetil-CoA, que é reduzido a acetaldeído e posteriormente reduzido a etanol. Várias linhas de evidência sugerem que a conversão de piruvato em acetil-CoA limita o título de etanol em C. thermocellum. A via de conversão direta de piruvato em acetaldeído pela enzima piruvato descarboxilase (PDC) é mais simples que a nativa porque requer menos reações enzimáticas e é mais favorável termodinamicamente em condições padrão. Embora a enzima PDC tenha sido transferida com sucesso para vários organismos mesofílicos, ela não parece funcionar bem acima de 45°C in vivo. Houve várias tentativas de introduzir genes pdc em C. thermocellum, porém o título máximo que alcançamos foi de 21 g/L, e a atividade Pdc de Acetobacter pasteurianus foi 100 vezes menor do que o observado em Escherichia coli (0,3 U/mg vs. 31 U/mg). Achamos que esse problema é devido ao dobramento e, portanto, o desafio neste projeto será aumentar a termoestabilidade da proteína PDC. Para tanto, propomos construir uma biblioteca de mutagênese de saturação de sítio único da proteína Pdc de A. pasteurianus (10.621 membros). Em seguida, examinaremos essa biblioteca em C. thermocellum para aumentar a produção de etanol. Mutações promissoras também serão usadas para desenvolver modelos computacionais de estabilidade de proteínas. (AU)