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Melhoria da via de produção de etanol por bactérias termofílicas envolvendo piruvato descarboxilase: triagem de biblioteca e reintrodução em C. Thermocellum

Processo: 22/05314-2
Modalidade de apoio:Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2022
Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2025
Área de conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Daniel Groban Olson
Beneficiário:Milena Andreotti Minetto
Instituição Sede: Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:18/25682-0 - Laboratório de biocombustíveis avançados de segunda geração, AP.BIOEN.SPEC
Assunto(s):Biotecnologia   Engenharia genética   Engenharia de proteínas   Produção de etanol   Bactérias   Piruvato descarboxilase   Clostridium thermocellum   Mutagênese   Acetobacter   Estabilidade de proteínas
Palavra(s)-Chave do Pesquisador:biotecnologia | engenharia de proteínas | engenharia genética | Biotechnology and Bioengineering

Resumo

Várias linhas de evidência sugerindo que a conversão de piruvato em acetil-CoA limita o título de etanol. Em muitas bactérias termofílicas, incluindo C. thermocellum, essa conversão é mediada pela enzima piruvato ferredoxina oxidorredutase (PFOR). Para identificar gargalos metabólicos em enzimas de C. thermocellum, substituímos as enzimas de T. saccharolyticum por enzimas de C. thermocellum. Das três enzimas que testamos, AdhE (que fornece atividade de acetaldeído desidrogenase e álcool desidrogenase) e NfnAB (que transfere elétrons de ferredoxina e NADH para NADP+) não limitaram o título de etanol em T. saccharolyticum (a produção de etanol foi > 60 g/L ). No entanto, Pfor reduziu a produção de etanol em 7 vezes, de 60 g/L para 9 g/L (Cui et al. em revisão). Em uma segunda linha de evidência, a expressão da enzima Pfor de T. saccharolyticum em C. thermocellum aumentou o título de etanol de 10 para 20 g/L (Hon et al. em revisão).A piruvato descarboxilase (PDC) é uma enzima utilizada por Saccharomyces cerevisiae e Zymomonas mobilis, dois organismos conhecidos por sua capacidade de produzir etanol em alto título (Olson et al., 2015). Embora esta enzima tenha sido transferida com sucesso para vários organismos mesofílicos, ela não parece funcionar bem acima de 45°C in vivo. Houve várias tentativas de introduzir genes pdc em C. thermocellum, no entanto, o título máximo que alcançamos foi de 21 g/L, e a atividade da enzima foi 100 vezes menor do que observamos em E. coli (0,3 U/mg vs 31 U/mg) (Tian et al., 2017). Achamos que esse problema é devido ao dobramento (dados não publicados) e, portanto, o desafio é aumentar a termoestabilidade da proteína Pdc. Propomos construir uma biblioteca de mutagênese de saturação de sítio único da proteína Acetobacter pasteurianus Pdc (10.621 membros) usando o sistema CREATE (Garst et al., 2016) para garantir uma cobertura uniforme do espaço experimental. Em seguida, examinaremos essa biblioteca em C. thermocellum para aumentar a produção de etanol. Mutações promissoras também serão usadas para desenvolver modelos computacionais de estabilidade de proteínas. (AU)

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