Biogênese da Vesícula da Matriz (VM) durante a mineralização fisiológica e calcificação ectópica.

• Processo: 23/14655-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2024
• Data de Término da vigência: 31 de março de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Enzimologia
• Pesquisador responsável: Pietro Ciancaglini
• Beneficiário: Luiz Henrique da Silva Andrilli
• Supervisor: Jose Luis Millan
• Instituição Sede: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, La Jolla, Estados Unidos
• Vinculado à bolsa: 21/13140-1 - Estudo da interação de PHOSPHO1 e nSMase2 com membranas modelo: uma possível correlação na secreção de vesículas da matriz, BP.DR
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biogenesis | Biomineralization | bone diseases | Ectopic Calcification | nSMase2 | Phospho1 | Bioquímica de Macromolécula

Resumo

A mineralização do tecido ósseo é um processo altamente ordenado que se inicia com a liberação de vesículas da matriz (VM) da membrana plasmática das células osteogênicas, responsáveis por fornecer as condições necessárias para a nucleação e crescimento dos primeiros cristais de fosfato de cálcio, que são posteriormente liberados na matriz orgânica para propagar a mineralização. Pouco se sabe sobre os fatores que regulam o surgimento da VM a partir de células progenitoras, porém, a presença da Esfingomielinase (nSMase2), enzima chave na biogênese das vesículas extracelulares e presente no proteoma da VM, aponta para o seu potencial envolvimento. Neste contexto, este projeto propõe um estudo abrangente da interação da nSMase2 com modelos de membrana (monocamadas e bicamadas) que mimetizam a composição lipídica da VM, abundante em colesterol e esfingomielina. Além disso, um possível mecanismo de sinergia entre nSMase2 e fosfoetanolamina/fosfocolina Fosfatase 1 (PHOSPHO1), que utiliza fosfocolina (produto da clivagem da esfingomielina por nSMase2) como substrato para gerar Pi, será investigado sobre seu envolvimento na secreção de VM, uma vez que células osteogênicas de animais nocaute de PHOSPHO1 apresentam biogênese de VM bastante reduzida. Compreender o mecanismo de biogênese da VM é de suma importância para compreender melhor o mecanismo de iniciação da mineralização dentária esquelética e a fisiopatologia dos distúrbios de calcificação ectópica e para permitir o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Assim, os objetivos do meu projeto de pesquisa são: I) utilizar modelos miméticos constituídos por lipídios de VM murino nativo, incorporando-os com nSMase2 e PHOSPHO1 para observar a formação de vesículas com auxílio de técnicas microscópicas como Cryo-TEM, óptica microscópio e microscópio de fluorescência; II) utilizar PHOSPHO1 nativo e mutantes inativos de PHOSPHO1 para entender se a atividade catalítica desta enzima é necessária para seu papel na biogênese da VM, ou se essa função é independente de sua atividade catalítica geradora de Pi e III) utilizar inibidores de nSMase2 e PHOSPHO1 em culturas celulares de osteoblastos e condrócitos para observar a biogênese da VM por essas células e IV) estudar a interrupção da biogênese da VM in vivo e em culturas primárias de células osteogênicas nocaute obtidas de camundongos knockout duplos PHOSPHO1, nSMase2 e PHOSPHO1/nSMase2 . Todas estas tarefas serão realizadas durante o ano de 2024 no Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, La Jolla, San Diego, CA, EUA, no laboratório, e sob a supervisão, do Prof. infraestrutura para este projeto, incluindo modelos animais knock-out, culturas de células primárias, mutagênese e expressão de proteínas e instrumentação necessária, como uma instalação Cryo-TEM e outras modalidades de microscopia para caracterizar a biogênese de VM.