Desenvolvimento de variantes de uma transcriptase reversa comercial com estabilidade térmica aprimorada

• Processo: 25/03075-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pesquisa Inovativa em Pequenas Empresas - PIPE
• Data de Início da vigência: 01 de fevereiro de 2025
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Felipe Ribaldo Ferreira da Costa
• Beneficiário: Felipe Ribaldo Ferreira da Costa
• Empresa: Cellco Biotec do Brasil Ltda
• CNAE: Fabricação de produtos químicos não especificados anteriormente ; Pesquisa e desenvolvimento experimental em ciências físicas e naturais
• Vinculado ao auxílio: 24/05367-4 - Desenvolvimento de Variantes de uma Transcriptase Reversa Comercial com Estabilidade Térmica Aprimorada, AP.PIPE
• Assunto(s): Mutagênese Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) Enzimas Estabilidade térmica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: M-Mlv-Rt | Mutagênese | Rt-Pcr | Transcriptase Reversa | Desenvolvimento de uma enzima de alto desempenho empregada em testes moleculares como RT-PCR e RT-LAMP

Resumo

As transcriptases reversas (RTs) são enzimas com capacidade de sintetizar uma fita complementar de DNA a partir de uma molécula de RNA como molde. Rotineiramente empregadas em laboratórios de Biologia Molecular, as RTs ampliam as possibilidades de pesquisa e aplicação nas áreas da saúde, agropecuária, veterinária e industrial. Entretanto, um desafio recorrente ao uso prático de tais enzimas se dá pela manipulação de RNAs longos e/ou com estruturas secundárias complexas que afetam a continuidade da reação, gerando produtos incompletos. Alternativamente, o uso de temperaturas reacionais elevadas configura uma estratégia recomendada para viabilizar ou otimizar a transcrição reversa. Por essa razão, RTs ideais para aplicações biotecnológicas são aquelas termoestáveis, sintetizadoras de longas cadeias de DNA complementar e com atividade satisfatória em altas temperaturas. Nesse contexto, diversas metodologias de engenharia genética foram usadas para o melhoramento de suas propriedades, destacando-se os mutantes da RT do vírus da leucemia murina de Moloney (M-MLV-RT). O mercado brasileiro ainda demonstra significativa dependência de importações de RTs, resultando em custos elevados e longos prazos de entrega. Assim, a busca por variantes aprimoradas da M-MLV-RT compatíveis às RTs comercializadas por competidores internacionais caracteriza-se como uma estratégia promissora. O projeto proposto pela Cellco Biotec busca abastecer as demandas científico-experimentais do mercado nacional com uma RT inovadora e genuinamente brasileira, de alta qualidade e com vantagens econômicas - preços justos e competitivos, agilidade e pronta disponibilidade. Para isso, mutações randômicas serão introduzidas por epPCR na sequência codificante (CDS) da versão geneticamente engenheirada da M-MLV-RT atualmente comercializada pela empresa. Os produtos amplificados serão clonados em plasmídeos de expressão de E. coli e os mutantes gerados serão triados pelo método Hot Colony Filtration Blot para seleção de proteínas termoestáveis ao nível de colônia. Adicionalmente, mutações pontuais nos resíduos D200, L603 e E607 também serão induzidas por mutagênese sítio-dirigida à CDS-controle e seus efeitos avaliados. Esta proposta, portanto, possui potencial para atingir nível 8 de maturidade tecnológica ao término de sua plausível Fase 2, obtendo-se uma RT mutante aprimorada com eminente retorno comercial e científico à realidade nacional.