Estudos estruturais de nitrilases degradadoras de cianeto usando Criomicroscopia Eletrônica com Resolução Temporal

• Processo: 26/04449-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 2026
• Data de Término da vigência: 28 de fevereiro de 2027
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Andrea Balan Fernandes
• Beneficiário: Valeria Del Carmen Valle-Riestra Felice
• Supervisor: Stephen Paul Muench
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: University of Leeds, Inglaterra
• Vinculado à bolsa: 24/02456-6 - Estudos estruturais e funcionais de nitrilases degradadoras de cianeto (CHT) e sua dependência do pH, BP.DD
• Assunto(s): Biorremediação Biotecnologia Elementos estruturais de proteínas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biorremediação | biotecnologia | Crio-Microscopia | dependência pH | enzimas degradadoras | nitrilases degradadoras de cianeto | Estrutura de proteínas

Resumo

O cianeto (CN) é um composto tóxico amplamente utilizado em diferentes indústrias. Como ácido fraco, com pKa de 9,22 a 25 °C, sua biorremediação é desafiadora, pois é necessário um pH acima de 9 para evitar a volatilização, condição na qual a maioria das enzimas apresenta atividade reduzida.Essas enzimas compartilham um enovelamento ¿-¿-¿-¿ e contêm três resíduos catalíticos: cisteína, glutamato e lisina. As nitrilases envolvidas na degradação do cianeto são classificadas como cianeto hidratases (CynHs), que produzem formamida, e cianeto dihidratases (CynDs), que geram amônia e ácido fórmico. Estudos funcionais e estruturais dessas enzimas podem possibilitar o desenvolvimento de variantes ativas em pH mais elevado, abrindo novas oportunidades para a biorremediação.Em nosso trabalho recente, caracterizamos estruturalmente a CynH de Gloeocercospora sorghi (2,0 Å) e a CynD de Bacillus safensis PER-URP-08 (2,2 Å), determinando suas estruturas tridimensionais por microscopia crioeletrônica (cryo-EM). Os modelos obtidos revelaram características C-terminais previamente não descritas e interações intermoleculares específicas nas interfaces A, C, D e F. Identificamos elementos estruturais que definem a entrada do sítio ativo, um núcleo catalítico conservado e diversos resíduos aromáticos ao redor dessa região.Ambas as enzimas oligoméricas apresentaram densidades eletrônicas nos sítios ativos conservados (E48, C164 e K130 em CynD; E46, C163 e K128 em CynH), compatíveis com moléculas de água que podem representar a posição de ligação do cianeto. Notavelmente, resíduos aromáticos ao redor do sítio ativo (S134 e F192 em CynD; T132 e Y190 em CynH) podem contribuir para vias catalíticas distintas.No entanto, o mecanismo enzimático permanece pouco compreendido, ressaltando a necessidade de abordagens capazes de capturar as mudanças estruturais que ocorrem durante a catálise para testar nossa hipótese. Neste projeto, aplicaremos cryo-EM com resolução temporal (time-resolved cryo-EM) para capturar essas transições estruturais no sítio ativo, fornecendo insights mecanísticos sobre a base molecular da atividade das nitrilases. (AU)