Texto completo
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| Autor(es): |
Izabella Agostinho Pena
Número total de Autores: 1
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| Tipo de documento: | Tese de Doutorado |
| Imprenta: | Campinas, SP. |
| Instituição: | Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia |
| Data de defesa: | 2015-06-08 |
| Membros da banca: |
Paulo Arruda;
Opher Gileadi;
Wyatt Yue;
Mário Henrique Bengtson;
Pedro Otavio de Campos Lima
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| Orientador: | Paulo Arruda; José Andrés Yunes |
| Resumo | |
A via da sacaropina é considerada a principal rota para o catabolismo de lisina em mamíferos, na qual a enzima Aminoadipato Semialdeído Sintase (AASS) catalisa a oxidação da lisina ao aminoadipato semialdeído (AASA). Este é imediatamente oxidado a ácido aminoadípico (AAA) por ação da enzima Aminoadipato Semialdeído Desidrogenase (AASADH, codificada pelo gene aldh7a1). Em humanos, mutações no gene AASS são a causa da hiperlisinemia, um erro inato do metabolismo, porém benigno. Por outro lado, mutações no gene Aldh7a1 causam Epilepsia Dependente de Piridoxina (PDE), na qual o acúmulo de AASA e sua forma cíclica, Piperideine-6 Carboxilato (P6C), são consideradas as principais causas desta doença. Estes compostos causam depleção de Piridoxal-5¿ fosfato (PLP) do organismo por meio da formação de produtos de condensação com o composto P6C. Apesar de existir uma rota alternativa de degradação de lisina (conhecida como via do pipecolato), hipotetizamos que os níveis elevados de AASA/P6C observados no plasma e urina de pacientes com PDE decorrem, principalmente, da atividade da via da sacaropina, especificamente da enzima AASS. Durante o presente trabalho de doutorado, desenvolvemos um novo método quantitativo de espectrometria de massas (LC-MS/MS) que permitiu a analise dos metabólitos da degradação de lisina em plasma e tecidos de camundongos. Como resultado da quantificação de metabólitos e também experimentos de rastreio de 15N (usando-se injeção de lisina marcada no nitrogênio ? ou ?) sugerimos a enzima AASS como a principal enzima de degradação de lisina do organismo. Desta forma, esta enzima seria a responsável pela síntese da maior parte do AASA/P6C acumulado em pacientes de PDE e, sendo que esta enzima é principalmente hepática e renal, sugerimos estes órgãos como os principais sítios de produção destes compostos tóxicos. Adicionalmente, a ideia de que a via do pipecolato possui apenas um papel minoritário no metabolismo geral de lisina é também suportada por esses experimentos, onde cerca da metade deste composto circulante provavelmente se origina da via da sacaropina. Este efeito também foi observado e discutido por nós em outros modelos biológicos como bactéria (Ruegeria pomeroyi) e plantas (Zea mays). Sugerimos, portanto, que a escolha da AASS como alvo terapêutico para desenvolvimento de inibidores seja uma nova alternativa para tratamento de PDE, pois seria observada redução dos níveis tóxicos de AASA/P6C. Observamos que o uso de shRNA para realizar knockdown da expressão do gene aass em células HEK293T não resultou em nenhum fenótipo detrimental e também não causou indução dos genes da via do pipecolato. Ao estudarmos células primárias de cinco distintos pacientes de PDE (modelo de fibroblastos de pele) observamos que estas células possuem maior sensibilidade à presença de Lisina ao meio de cultura se comparadas à células normais. Como prova de conceito observamos que o knockdown da expressão de aass usando shRNA restaura a sobrevivência das células PDE na presença de altos níveis de lisina. Isso pode sugerir o uso de ASO (Anti-sense Oligonucleotides) ou inibidores da atividade da AASS para tratamento da PDE. Para promover melhor entendimento da bioquímica e biologia estrutural deste novo alvo terapêutico, expressamos, purificamos e obtivemos com sucesso a estrutura cristalográfica do domínio Sacaropina Desidrogenase (SDH) da enzima AASS humana. Propriedades cinéticas e bioquímicas da enzima foram estudadas, bem como foram realizados ensaios de screening de ligantes por desnaturação térmica e ensaios de atividade. Foram feitas várias rodadas de desenho computacional de inibidores baseados na estrutura do sítio ativo com o intuito de usar esta tecnologia para desenhar compostos que atuem competindo com a sacaropina pelo sítio ativo (AU) | |
| Processo FAPESP: | 12/00235-5 - Mecanismos de indução da via da sacaropina em células humanas |
| Beneficiário: | Izabella Agostinho Pena |
| Modalidade de apoio: | Bolsas no Brasil - Doutorado Direto |