Estudo da ação de NSP4 de rotavírus sobre a permeabilidade celular in vitro e o acúmulo de fluidos intestinais em camundongos (modelo in vivo)

Autor(es)

Jéssica Wildgrube Bertól

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2016-08-25

Membros da banca

Maria Silvia Viccari Gatti; Elizete Aparecida Lomazi; José Luiz Proença Módena; Gustavo Bueno Gregoracci; Dolores Ursula Mehnert

• Orientador: Maria Silvia Viccari Gatti

Resumo

Rotavírus do grupo A (HuRV-A) são os principais agentes da diarreia aguda em crianças no mundo e responsáveis por altos índices de morbidade e mortalidade. Desde 1980, pesquisas para o desenvolvimento de vacinas eficazes contra a rotavirose vêm sendo desenvolvidas. No Brasil, em 2006, estabeleceu-se a vacinação compulsória com a vacina Rotarix®, com HuRV-A atenuados do genotipo G1P[8], de maior prevalência no mundo. Entretanto, pesquisadores têm relatado o importante papel da proteína não estrutural NSP4 de rotavírus (RV) nas diarreias, por sua ação enterotóxica que leva ao aumento da permeabilidade paracelular quando da infecção. Há também relatos de que as vacinas atuais não teriam uma ação totalmente eficaz anti-rotavírus dado o papel da NSP4 na diarreia. Portanto, estudos são necessários para contribuir na elucidação do mecanismo de ação desta proteína, incluindo a verificação das diferenças na virulência entre os genotipos E1, E2 e E3 da NSP4 de HuRV-A. Assim, o objetivo principal desse trabalho foi investigar se diferentes peptídeos enterotóxicos (aminoácidos 114-135) da NSP4, correspondentes às sequências mais prevalentes dos genotipos E1, E2 e E3, alteram distintamente a permeabilidade paracelular in vitro e levam a quadros de diarreia mais severos em camundongos. Para isto, amostras fecais de HuRV-A genotipadas para diferentes genotipos E da NSP4 foram submetidas a adaptação em cultura celular, para posterior estudo da diferença na capacidade de alteração da permeabilidade paracelular. Em paralelo, a readaptação de cepas de RV padrão, Wa, vacinal Rotateq® e K8, possibilitou a implementação da técnica de hibridização por molecular beacons (MB). A padronização desta técnica pode facilitar a detecção de HuRV-A infecciosos em amostras fecais, evitando passagens sucessivas e a necessidade de visualização de efeito citopático para a definição da adaptação da cepa viral. O sequenciamento do gene da NSP4 de 41 amostras de HuRV-A de origem fecal, coletadas nos anos de 1994, 2006, 2007, 2009 e 2010, evidenciou a relação entre os genotipos G2P[4] e E2, já que 40 amostras apresentaram esta combinação genotípica. A análise aminoacídica das sequências de genotipo E2 confirmou sua variação intragenotípica, principalmente na porção C-terminal da proteína. Após a avaliação da diversidade gênica e aminoacídica da NSP4, peptídeos sintéticos (PEPs) enterotóxicos (aa 114-135) foram analisados quanto a capacidade de alteração da integridade da monocamada de células Caco-2 pela mensuração da resistência elétrica transepitelial (TEER) e utilização do marcador de permeabilidade paracelular FITC-Dextran. Os resultados indicaram que os PEPs não alteram a integridade da monocamada celular e, consequentemente, não contribuiriam para a diarreia por este modo de ação. Em relação a capacidade de indução de diarreia, o PEP3 (genotipo E3) foi o mais virulento, seguido pelos PEP2 (genotipo E2) e PEP1 (genotipo E1). A análise das diferenças aminoacídicas entre os PEPs sugere que características como hidrofobicidade e polaridade dos resíduos, em posições específicas, são importantes para a virulência da NSP4. Os resultados obtidos contribuem para estudos que avaliam a relação entre as alterações aminoacídicas da NSP4 e a indução de diarreia (AU)

• Processo FAPESP: 11/23865-1 - Estudo da ação de NSP4 de rotavírus sobre a permeabilidade celular in vitro e o acúmulo de fluidos intestinais em ratos (modelo in vivo)
• Beneficiário: Jéssica Wildgrube Bertol
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado