Heterologous production, purification, functional characterization, and structural prediction of the human mitochondrial pyruvate carrier

Autor(es)

José Edwin Neciosup Quesñay

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2020-11-18

Membros da banca

Andre Luís Berteli Ambrosio; Richard Charles Garratt; Maria Cristina Nonato; Shaker Chuck Farah; Germán Gustavo Sgro

• Orientador: Andre Luís Berteli Ambrosio

Resumo

O piruvato é considerado o ponto central do metabolismo celular, chave para a geração de energia e blocos biossintéticos. Quando a oxidação do piruvato pelo ciclo do ácido cítrico é necessária, o piruvato citosólico deve ganhar acesso à matriz mitocondrial em um processo que se acredita envolver ativamente duas subunidades carreadoras de piruvato mitocondrial (MPC) organizadas em hetero-oligômeros. Desde 2012, quando as identidades moleculares de mamíferos MPC1 e MPC2 (e MPC3 em leveduras) foram finalmente apresentadas, vários estudos in vitro e in vivo revelaram uma interação inesperada entre duas ou mesmo três subunidades de proteínas que definem diferentes conjuntos funcionais, em um contexto metabólicos específicos; estes têm implicações claras na fisiologia da homeostase e em algumas doenças. No entanto, o mecanismo funcional baseado em estrutura de MPC permanece indefinido, apesar dos intensos esforços empregando ferramentas computacionais e técnicas experimentais de última geração. Nesta tese, a produção recombinante de MPC humano, através de uma estratégia de co-expressão, é incialmente descrita; no entanto, não foi observada formação substancial de complexos e, predominantemente, subunidades individuais foram purificadas. Em contraste com MPC1, que co-purifica com uma chaperona de levedura, demonstramos que os homo-oligômeros MPC2 promovem o transporte eficiente do piruvato em proteolipossomos. Os requisitos funcionais derivados e as características cinéticas do MPC2 assemelham-se aos demonstrados anteriormente para o MPC na literatura. De maneira distinta, a inibição química do transporte é observada apenas para um derivado de tiazolidinediona. O papel de transporte autônomo para MPC2 é validado em células, quando a expressão ectópica de MPC2 humano em levedura sem MPC endógeno estimulou o crescimento e aumentou o consumo de oxigênio celular. A detecção de várias espécies oligoméricas de MPC2 em isolados mitocondriais, proteínas purificadas e bicamadas lipídicas artificiais sugerem complexos funcionais de alta ordem (> 2 subunidades). Mudanças significativas no conteúdo da estrutura secundária de MPC2, conforme sondado por dicroísmo circular de radiação sincrotron, suportam ainda mais a interação entre a proteína e os ligantes. A cristalografia de raios X foi prejudicada pela incapacidade de se obter cristais adequados tanto, por difusão de vapor, quanto em fase cúbica lipídica, apesar da obtenção de condições iniciais promissoras. Por fim, a análise por crio-microscopia eletrônica de MPC2 reconstituído em nanodiscos de copolímeros sintéticos permitiu a proposição de uma montagem estequiométrica para o complexo. Coletivamente, nossos resultados fornecem bases para o papel independente do MPC2 na homeostase e doenças relacionadas ao metabolismo desregulado do piruvato e representam uma rota promissora para a determinação de um modelo atômico de alta resolução para MPC2 humano. (AU)

• Processo FAPESP: 15/02734-7 - Estudos funcionais e estruturais de quatro homólogos recombinantes do complexo carreador mitocondrial de piruvato
• Beneficiário: José Edwin Neciosup Quesñay
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto