Texto completo
| |
| Autor(es): |
Ana Gilhema Gomez Duran
Número total de Autores: 1
|
| Tipo de documento: | Tese de Doutorado |
| Imprenta: | São Paulo. |
| Instituição: | Universidade de São Paulo (USP). Conjunto das Químicas (IQ e FCF) (CQ/DBDCQ) |
| Data de defesa: | 2005-10-14 |
| Membros da banca: |
Clelia Ferreira Terra;
Ivo Lebrun;
Maria Teresa Machini de Miranda;
Carla Columbano de Oliveira;
Ivarne Luis dos Santos Tersariol
|
| Orientador: | Clelia Ferreira Terra |
| Resumo | |
A trealase intestinal de Tenebrio molitor foi purificada após três etapas cromatográficas (interação hidrofóbica, troca iônica e gel filtração), obtendo-se uma recuperação de 46 %, uma atividade específica de 16,5 U/mg de proteína e um enriquecimento de 73 vezes. A proteína purificada apresenta uma massa molecular de 58 kDa estimada por plotes de Ferguson, pH ótimo de 5,3 e Km de 0,43 ± 0,03 mM. Estudos de inibição com a enzima purificada mostraram que a mesma é inibida competitivamente por amigdalina (Ki = 0,22 mM), prunasina (Ki = 0,43 mM), florizina (Ki = 0,50 mM), floretina (Ki = 0,008 mM), metil-α-manosídeo (Ki = 0,43 mM), salicina (Ki = 186 mM), e glucono-δ-lactona (Ki = 1,4 mM). Mandelonitrila apresentou inibição mista com Ki = 3,8 e -α = 1,5. A enzima não apresentou inibição por 1,10 fenantrolina, gentibiose, metil-α-glucosídeo e Tris, em concentração de mM, 10 mM, 200mM, e 264 Mm, respectivamente. Experimentos de inibição, inibição múltipla e de proteção da enzima contra modificadores de resíduos específicos de aminoácidos permitiram idealizar um esquema para o sítio ativo da trealase. Esse sítio ativo teria dois sítios assimétricos para a ligação de glicose. Em um dos sub-sítios liga-se o inibidor floritina e no outro os inibidores metil-α-manosídeo e glucono-δ-lactona. Nesse último está presente um resíduo de histidina que tem como papel modular o pKa do carboxilato catalítico. Esse e o resíduo de arginina que atua como doador de prótons, encontra-se na região entre os dois sub-sítios. RT-PCR foi usado para clonar o cDNA codifica a trealase intestinal de T. molitor. Esta proteína é solúvel e apresenta massa molecular prevista pela sequência de 61 kDa. Tomando por base a seqüência de aminoácidos, esta trealase pode ser classificada na família 37 das glicosídeo hidrolases e faz parte do clã G, onde não se conhecem quais são os grupos envolvidos em catálise e nem a estrutura tridimensional de seus componentes. (AU) | |
| Processo FAPESP: | 02/07431-2 - Identificacao dos grupos presentes no sitio ativo e caracterizacao estrutural da trealase de tenebrio molitor. |
| Beneficiário: | Ana Gilhema Gomez Duran |
| Modalidade de apoio: | Bolsas no Brasil - Doutorado |