Produção, purificação e caracterização da enzima lacase do fungo Cochliobolus sativus

Autor(es)

Suelen de Barros Sampaio

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Escola de Artes, Ciências e Humanidades (EACH)
• Data de defesa: 2019-11-12

Membros da banca

Felipe Santiago Chambergo Alcalde; Sirlene Maria da Costa; Marcia Zorello Laporta; Roberto Kopke Salinas

• Orientador: Felipe Santiago Chambergo Alcalde

Resumo

O aumento na demanda mundial por etanol atrelado a preocupações ambientais relacionadas ao desbalanceamento de carbono na atmosfera em decorrência da utilização de combustíveis fósseis, impulsionou o interesse por combustíveis renováveis. O bagaço da cana-de-açúcar é constituído principalmente por lignina, hemicelulose e celulose, estes dois últimos podem ser decompostos e fermentados em etanol. Durante a hidrólise da biomassa lignocelulósica ocorre a ação sinergética de um complexo enzimático para obter os açúcares solúveis fermentáveis, no qual recentes pesquisas têm demonstrado a importância das enzimas oxidorredutases na despolimerização da lignina. O objetivo desse estudo foi identificar o fungo filamentoso BBF210, avaliar sua utilização na produção de lacase em meio de cultura contendo bagaço de cana-de-açúcar, purificar e caracterizar a oxidorredutase deste fungo, além de expressar e purificar a enzima lacase recombinante. Por análise de taxonomia clássica e molecular o fungo filamentoso BBF210 foi identificado como produtor de enzimas oxidorredutases, pertencente à espécie Cochliobolus sativus. A análise computacional do genoma de C. sativus, permitiu a identificação do cDNA do gene com 1575 pb, que codifica a putativa enzima lacase de 524 aminoácidos e massa molecular estimada em 57,7 kDa. O gene foi sintetizado e clonado nos vetores (pET, pTrc e pFLAG), para expressão em E. coli. A enzima lacase recombinante foi expressa e purificada. O fungo C. sativus foi avaliado quanto à sua capacidade de produzir oxidorredutases em meio de cultura MSB (caldo de cultura com sais minerais) contendo 0,5% de bagaço de cana-de-açúcar e os resultados mostraram uma maior atividade da enzima lacase com o substrato ABTS, quando comparado às peroxidases. Após o 7º dia de cultivo a enzima foi precipitada com etanol a 50% e purificada em duas etapas por cromatografia de troca iônica (coluna Q-sepharose). A fração pura de lacase apresentou 3.264,32 U/L e 11,25 U/mg. Os resultados sugerem que a proteína nativa é uma isoenzima com massa molecular de aproximadamente 50 kDa, similar à proteína recombinante, como confirmado em análise por western blot. A atividade de lacase nativa foi determinada com o substrato ABTS por zimograma e espectrofotometria, com as constantes catalíticas Km= 0,094 mM e Vmax= 1,62 mM s-1. O pH e temperatura ótimos da enzima foram determinados como sendo 4,0 e 30ºC, respectivamente, com estabilidade térmica a 30°C e temperatura ideal na faixa entre 10 e 50°C. Sendo a lacase uma oxidorredutase fundamental no processo de degradação da biomassa vegetal, o presente estudo fornece informações sobre a enzima expressa por C. sativus e descreve pela primeira vez a produção, purificação e caracterização da enzima nativa deste fungo. O conhecimento de suas características e propriedades bioquímicas podem ser importantes para investigações científicas mais aprofundadas em torno da identificação e caracterização da enzima e colaborar para a otimização de processos que utilizam oxidases em coquetéis enzimáticos, tanto para a produção de etanol utilizando a metodologia 2G quanto para outros processos biotecnológicos (AU)

• Processo FAPESP: 16/23628-3 - Enzimas oxidorredutases do fungo Cochliobolus sp
• Beneficiário: Suelen de Barros Sampaio
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado