Análise e expressão de genes de PKS II e de carboidrases provenientes de bibliotecas metagenômicas

Autor(es)

Elisângela Soares Gomes

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Jaboticabal. 2015-08-20.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. Jaboticabal
• Data de defesa: 2015-02-12
• Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos

Resumo

O clone metagenômico B5pl37 (inserto de 23 Kb) foi obtido por meio de uma prospecção por PCR para o conjunto gênico de Policetídeos Sintases tipo II (PKSII) em uma biblioteca cosmidial de amostra de solo de bosque de eucaliptos (S.E.). As PKSII são responsáveis pela produção de inúmeras moléculas bioativas, dentre os quais se destacam os antibióticos policetídicos. Parte da sequência do inserto (cobertura de 27-43%) apresentou similaridade de 77-78% com bactérias da família Streptomycetaceae (ferramenta BlastN, Genbank). Além da PKS II, a anotação gênica permitiu identificar genes relacionados à degradação de compostos lignocelulósicos importantes para a produção de combustíveis de segunda geração (2G): uma β- glicosidase, uma celulase e uma Multicopper oxidase (MCO). Considerando a importância industrial destes genes, este trabalho teve como objetivo a caracterização in silico e in vitro/vivo dos mesmos. As análises in silico auxiliaram a identificar a arquitetura do sítio ativo (modelo de estrutura proteica obtida por homologia) e famílias enzimáticas (com base em agrupamentos fenéticos com sequências de enzimas de atividade conhecida). Quanto às análises in vitro/vivo, foram realizados experimentos de expressão em vetor pET28a em Escherichia coli para as enzimas celulase (linhagens de E.coli BL21; C41 e Artics) e β-glicosidase (E.coli BL21), enquanto o gene MCO foi submetido à síntese in vitro para um estudo posterior. Foi feita a caracterização cinética da β-glicosidase (melhor rendimento na expressão e purificação), que obteve os parâmetros catalíticos: Vmax de 0,79 μM/min; km de 0,46 mM.. Os respectivos valores de temperatura e pH ótimos para a enzima foram 37°C e pH7-7,5; e a enzima foi capaz de manter uma atividade acima de 80% para uma faixa de pH 6,5-8,0 e temperatura 35- 40°C. Com relação à PKSII, foram iniciados os processos preparatórios para a... (AU)

• Processo FAPESP: 11/10981-3 - Análise e expressão de genes de pks ii e de carboidrases provenientes de bibliotecas metagenômicas
• Beneficiário: Elisângela Soares Gomes Pepe
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado