Estudo estrutural e funcional de hidrolases de glicosídeos de organismos termofílicos

Autor(es)

Leonardo Rodrigues de Almeida

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Carlos.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Física de São Carlos (IFSC/BT)
• Data de defesa: 2022-04-29

Membros da banca

João Renato Carvalho Muniz; João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa; Fernando Masarin; Ronaldo Alves Pinto Nagem

• Orientador: João Renato Carvalho Muniz

Resumo

O esgotamento das reservas de petróleo, a crescente demanda energética de países emergentes e a necessidade de redução da emissão de dióxido de carbono sinalizam a importância pela busca de novas fontes de energias renováveis. Contudo, para que tais fontes tenham um caráter de efetiva substituição e não apenas de complementação, se fazem obrigatórias pesquisas por novas formas de se obtê-la. Assim, a produção do bioetanol mediante a hidrólise de biomassas lignocelulósicas, como do bagaço de cana-de-açúcar, por celulases tem recebido grande destaque. Devido ao seu potencial de evolução e redução de custos, a hidrólise enzimática da celulose pode ser uma peça fundamental para a produção de açúcares, etanol 2G e ácidos carboxílicos, com um custo competitivo a longo prazo. Alguns organismos termófilos, como as bactérias Clostridium thermocellum e Lactobacillus gasseri, o fungo Thermothielavioides terrestris e a bactéria mesófila Bacillus licheniformis, são exemplos conhecidos por sua capacidade em secretar celulases. C. thermocellum produz um complexo proteico multienzimático extracelular chamado celulossomo, que demonstra elevada capacidade de realizar uma eficiente degradação de biomassa celulósica, em especial na porção cristalina da celulose. A enzima CtBgl3B, -glicosidase (BGl) celulossomal de C. thermocellum da família de hidrolases de glicosídeos GH3, foi expressa em E. coli (BL21), purificada por cromatografia de afinidade e de separação por massa molecular. Apresentou características termofílicas, mostrando alta atividade em temperatura acima de 60 °C, variando o pH de 4,57,0, com maior atividade em pH 5,5 a 70 °C. Tm em 70 °C, determinada por fluorimetria diferencial de varredura (DSF) e dicroísmo circular (CD). Além disso, teve avaliada sua atividade enzimática e parâmetros cinéticos avaliados com pNPG: At. Esp. = 124 U mg1, KM = 0, 37 (mM), constante catalítica kcat = 173 (s1), e eficiência catalítica kcat/KM = 469 (mM1 s1). A enzima também demonstrou capacidade em atuar contra os substratos sintéticos como pNPX (40%) e CpNPG2 (25%). Enquanto no teste de aditivos, teve suas taxas de conversões aumentadas em média 70% na presença de Triton X-100, e 60% com Tween20. Por outro lado, apresentou queda significativa nas reações com a presença de íons divalentes, DMSO e SDS respectivamente abaixo de 25-75% da atividade relativa ao pNPG. A estrutura cristalográfica da CtBGl3 foi determinada por meio da difração de raios-X usando substituição molecular, com os limites de resolução anisotrópicos em Å nas respectivas direções 3,47 (a), 2,22 (b) e 1,78 (c). Demonstrando um arranjo dimérico, e com indicadores da qualidade do refinamento Rwork e Rfree, respectivamente 0,20 e 0,23. Experimentos de espalhamentos de luz em múltiplos ângulos (MALS) e espalhamento de raios-X a baixo ângulos (SAXS) corroboram que em solução CtBGl3 também adota arranjo dimérico. A bactéria mesofílica B. licheniformis produz uma proteína hipotética BlYlmD, que foi expressa em E. coli (Rosetta DE3) e teve sua estrutura determinada a 2,66 Å de resolução. Esse domínio proteico, cujo alinhamento indicava a presença de um domínio Cu-oxidase_4 (PF02578), também encontrado em lacases, e amplamente distribuído entre procariotos e eucarioto, ou de uma CNF1/YfiH-like cisteína hidrolase putativa de B. licheniformis BlYlmD, chamou a atenção devido suas semelhanças sequenciais com domínios de lacases, bem conhecidos, e se tornou o objeto de estudo nesta pesquisa. Sua estrutura é classificada como uma proteína / que forma quatro camadas de /// com folhas beta antiparalelas mistas e se reúne em um dímero na unidade assimétrica. Não teve sua função caracterizada para as funções sugeridas. Recentemente, foi comparada a uma purina nucleosídeo fosforilase PNP FAMIN multifuncional. Porém, também sem detecção de nenhuma atividade enzimática, sendo o principal indício estrutural da falta de atividade centrado na conformação da His47, e as diferenças entre os resíduos Tyr106 (Phe) e Glu77 (Asp), que podem afetar o volume da cavidade catalítica impedindo a entrada dos substratos. (AU)

• Processo FAPESP: 16/09152-6 - Estudo estrutural e funcional de hidrolases de glicosídeos celulossomais termofílicas envolvidas no processo de hidrólise de biomassa lignocelulósica
• Beneficiário: Leonardo Rodrigues de Almeida
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado