Estabelecimento da metodologia CRISPR/Cas9 e obtenção de plantas knockout para genes candidatos a reguladores do splicing alternativo sob estresse térmico em arroz (Oryza sativa L.)

Autor(es)

João Henrique Servilha

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Biociências (IBIOC/SB)
• Data de defesa: 2024-04-22

Membros da banca

Cristiane Paula Gomes Calixto; Felipe Klein Ricachenevsky; Silvana Aparecida Creste Dias de Souza

• Orientador: Cristiane Paula Gomes Calixto

Resumo

O arroz é um dos alimentos mais consumidos no mundo, mas o estresse térmico afeta seu rendimento e qualidade dos grãos. Para identificar soluções mecanísticas que melhorem essa cultura diante das ameaças das mudanças climáticas, as respostas moleculares da termotolerância devem ser identificadas. O splicing alternativo de pré-mRNAs é um dos mecanismos envolvidos na resposta das plantas contra estresses, mas pouco se sabe sobre como a variação de isoformas transcritas é regulada por mudanças de temperatura. Os genes de arroz LOC_Os02g40900 e LOC_Os05g30140 são candidatos a reguladores de splicing sensíveis ao calor. Para investigar essa hipótese, foram gerados plasmídeos com base na metodologia CRISPR/Cas9 visando editar esses genes em plantas de arroz. Utilizando a estratégia de duplo direcionamento, foram escolhidas duas sequências-alvo na região codificante de cada gene. Essas sequências-alvo foram inseridas em vetores de expressão de plantas via PCR, subclonagem e Golden Gate Assembly. Os plasmídeos adequados foram confirmados por sequenciamento de Sanger e então inseridos em Agrobacterium, sendo confirmados por PCR de colônias. Para a transformação de plantas, calos de arroz foram obtidos induzindo a divisão de embriões indiferenciados em sementes de arroz. Após a indução e subcultivo dos calos, ocorreu a transformação via Agrobacterium, permitindo que os calos resistentes ao agente seletivo prosseguissem para o meio de regeneração, gerando plantas transgênicas, confirmadas por PCR e sequenciamento de Sanger para, pelo menos, uma das edições esperadas. (AU)

• Processo FAPESP: 21/12014-2 - Estabelecimento da metodologia CRISPR-Cas9 e obtenção de plantas nocaute em genes candidatos a reguladores do processamento alternativo em estresse térmico em arroz
• Beneficiário: João Henrique Servilha
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado