Edição de genomas de plantas de arroz utilizando sistemas CRISPR/Cas: Das aplicações ao melhoramento de plantas ao desenvolvimento de novas ferramentas moleculares

Autor(es)

Danyel Fernandes Contiliani

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2025-06-05

Membros da banca

Silvana Aparecida Creste Dias de Souza; Fernando Bonifacio Anacleto; Perla Novais de Oliveira; Zila Luz Paulino Simoes

• Orientador: Silvana Aparecida Creste Dias de Souza; Tiago Campos Pereira

Resumo

Há mais de uma década, o advento da tecnologia de engenharia de genomas CRISPR-Cas9 revolucionou inúmeras áreas do conhecimento, incluindo o melhoramento de plantas, se inovando e trazendo soluções para grandes problemas reais, como as mudanças climáticas. Contudo, a tese presente buscou explorar dois principais temas: (i) a caracterização funcional de genes associados a seca em cana-de-açúcar (Saccharum spp.) e arroz (Oryza sativa) e (ii) o desenvolvimento de novos editores de bases de citosinas. No Capítulo I, a família de fitocianinas de cana-de-açúcar foi investigada pela primeira vez, revelando 97 membros, sendo estes classificados de acordo com suas arquiteturas de domínios proteicos e seus resíduos de aminoácidos ligantes de íons Cobre. Dentre estas, algumas foram identificadas como diferencialmente expressas em cana-de-açúcar sob condições de seca moderada e severa. Curiosamente, também foi observada a modulação transcricional genótipo-dependente do gene codificador de uclacianina SCQGHR1013B08.g, apresentando perfis de expressão gênica contrastante entre genótipo sensível (\'IACSP97-7065\') e resistente à seca (\'IACSP94-2094\'). O potencial ortólogo de SCQGHR1013B08.g em arroz foi detectado - OsUCL23 - e nocauteado utilizando o sistema CRISPR-Cas9. Plantas de arroz nocaute Osucl23 foram submetidas a ensaios biométricos em condições normais e fisiológicos sob estresse de déficit hídrico. Em comparação às plantas selvagens, plantas Osucl23 apresentaram tamanho reduzido no estágio adulto. Em seca, estas plantas apresentaram um estado hídrico melhor e uma maior eficiência fotoquímica, resultando em maiores eficiências de carboxilação e uso de água. Estes resultados sugerem o amplo repertório de papéis moleculares de fitocianinas de cana-deaçúcar, incluindo a responsividade à seca, bem como reforça o papel protetor da regulação negativa de OsUCL23 à seca. No Capítulo II, 66 desaminases de citidinas desconhecidas foram prospectadas do reino animal e testadas em protoplastos de arroz contra o alvo OsCGRS55, comparando-as contra editores de bases bem estabelecidos, como hA3A-Y130F, hAID e PmCDA1. Posteriormente, as melhores candidatas foram testadas novamente em protoplastos de arroz para a edição de quatro diferentes genes alvos, OsALS, OsGN1a, OsGS3 e OsGW2, buscando verificar o potencial de edição destas desaminases de citidinas. De forma consistente, a desaminase de citidina OoA3GX2 se apresentou altamente eficiente tanto em protoplastos quanto em plantas de arroz transformadas por Agrobacterium tumefaciens. Além disso, OoA3GX2 foi capaz de apresentar níveis comparáveis de edição de bases em sítios GC/CC/TC/AC - sugerindo uma menor dependência de contextos genômicos -, menor taxas de indels, conversões C-para-R (R = A/G) e efeitos fora do alvo - indicando maior pureza dos produtos de edição gênica - e janelas de atividade mais amplas, possibilitando a conversão de outras citosinas inacessíveis para editores de bases convencionais. Este trabalho não apenas expande o repertório de editores de bases, mas apresenta um avanço na robustez desta tecnologia, viabilizando estratégias sofisticadas de engenharia genética em arroz e outras espécies. (AU)

• Processo FAPESP: 21/13478-2 - Edição de genomas em espécies de gramíneas via CRISPR/Cas9
• Beneficiário: Danyel Fernandes Contiliani
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado