Identificação de marcadores de pluripotência em células-tronco embrionárias e embriões suínos

Autor(es)

Flavia Regina Oliveira de Barros

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ/SBD)
• Data de defesa: 2009-01-22

Membros da banca

José Antonio Visintin; Mayra Elena Ortiz D\'Avila Assumpção; Fabíola Freitas de Paula Lopes

• Orientador: José Antonio Visintin

Resumo

Células-tronco embrionárias (CTE) são importantes para estudos de desenvolvimento embrionário, diferenciação e manipulação genética. Além disso, essas células podem ser utilizadas na terapia celular e organogênese in vitro. Na pesquisa sobre terapia celular a partir de CTE oriundas de embriões humanos, considerações éticas, morais e religiosas têm sido feitas por pesquisadores e leigos. Portanto, um modelo animal como o suíno (Sus scrofa) será bastante válido por transpor tais barreiras, visto que o suíno possui parâmetros fisiológicos semelhantes aos humanos. Apesar do alto potencial biomédico das CTE, existem dificuldades na manutenção da pluripotência in vitro dessas células em suínos. Portanto, estudos que visam elucidar os mecanismos de manutenção da pluripotência de CTE in vitro são necessários para viabilizar o cultivo dessas células. Os objetivos do presente estudo foram (1) isolar células-tronco embrionárias suínas a partir de blastocistos produzidos in vitro e in vivo; (2) comparar dois sistemas de cultivo in vitro das massas celulares internas (MCI) isoladas, MEF ou Matrigel e (3) identificar e comparar a expressão dos fatores de transcrição Nanog, Sox2 e FoxD3 em CTE e blastocistos suínos produzidos in vitro e in vivo. Assim, blastocistos suínos foram produzidos in vitro a partir da maturação e fecundação in vitro de oócitos de ovários obtidos em matadouro. Os embriões foram cultivados in vitro por 7 dias, até atingirem o estágio de blastocisto. Blastocistos suínos também foram produzidos in vivo, através de superovulação seguida de inseminação artificial de marrãs com 150 dias de idade. Para a colheita dos embriões, foi realizada lavagem dos cornos uterinos post-mortem cinco dias após a ovulação. Tanto blastocistos produzidos in vitro quanto os produzidos in vivo foram submetidos à imunocirurgia para isolamento da MCI. Brevemente, a zona pelúcida foi digerida com solução de pronase e os embriões incubados com soro de coelho anti-suíno para remoção das células do trofoectoderma e soro complemento de cobaia. A MCI resultante foi cultivada em meio para células-tronco (GMEM acrescido de 15% SFB, 0,1 mM ß-mercaptoetanol, 1% aminoácidos não essenciais e 4 ng/mL de bFGF) sobre monocamada de fibroblastos fetais murinos (MEF) inativados por radiação ou sobre Matrigel. Não foi observada diferença entre os dois sistemas de cultivo in vitro (MEF e Matrigel) na adesão das MCI isoladas. Também não foi verificada diferença entre os grupos de blastocistos, produzidos in vitro e in vitro, nas taxas de adesão das MCI cultivadas. Contudo, nenhuma colônia de CTE suínas foi obtida. A análise da expressão gênica em blastocistos produzidos in vitro e in vitro demonstrou que os genes Nanog e Sox2 são menos expressos em blastocistos produzidos in vitro. Contudo, a expressão do gene FoxD3, demonstrada pela primeira vez em suínos no presente trabalho, se mostrou semelhante entre os dois grupos de embriões. Visto que nenhuma linhagem de CTE legítima foi isolada em suínos até o momento, sugere-se que esta espécie possua requerimentos diferentes dos já conhecidos para as espécies murina e humana. Portanto, novos estudos são necessários para o estabelecimento de protocolos mais efetivos para o isolamento de CTE de suínos. (AU)

• Processo FAPESP: 06/58507-0 - Identificacao de marcadores de pluripotencia em celulas-tronco embrionarias de suinos.
• Beneficiário: Flavia Regina Oliveira de Barros
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado