Caracterização da localização subcelular da proteína THI1 de Arabidopsis thaliana.

Autor(es)

Sabrina Moutinho Chabregas

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Piracicaba.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALA/BC)
• Data de defesa: 2002-02-08

Membros da banca

Marcio de Castro Silva Filho; Francisco Gorgonio da Nobrega; Marie Anne van Sluys; Anete Pereira de Souza; Michel Georges Albert Vincentz

• Orientador: Marcio de Castro Silva Filho

Resumo

O produto do gene thi1 de Arabidopsis thaliana está provavelmente envolvido na biossíntese de tiamina (vitamina B1) e na proteção do DNA organelar contra danos. Estudos sobre a biossíntese da tiamina em plantas sugerem uma localização plastidial para este mecanismo, o que está de acordo com a existência de um peptídeo de trânsito cloroplástico (TP) na região N-terminal de THI1. Por outro lado, em leveduras a tiamina é sintetizada em mitocôndrias. Interessantemente, o cDNA de thi1 de A. thaliana complementa uma cepa de levedura com disrupção no gene homólogo thi4. A análise da seqüência de aminoácidos de THI1 revelou a presença de uma região capaz de formar uma estrutura do tipo a-hélice anfifílica, freqüentemente encontrada em preseqüências mitocondriais, localizada logo após o peptídeo de trânsito cloroplástico. O papel desta região na localização da proteína THI1 nas mitocôndrias foi comprovado a partir de ensaios envolvendo construções de genes quiméricos (contendo ou não a putativa seqüência de direcionamento mitocondrial) e um gene repórter (uidA). Estas construções foram introduzidas em plantas de tabaco e a localização da atividade GUS foi determinada nas frações subcelulares das plantas transgênicas. Análise direta da presença de THI1 nas mitocôndrias e cloroplastos de Arabidopsis foi realizada via imunolocalização. Também foram fornecidas evidências que as duas isoformas organelares são codificadas por um único transcrito nuclear. Experimentos de transcrição/tradução in vitro indicaram a ocorrência de dois produtos da tradução a partir de códons de iníciação em fase de leitura. Mutações sítio-específicas na seqüência de thi1 acoplados à experimentos usando a proteína fluorescente verde (GFP) mostraram que a tradução no primeiro AUG determina a localização da proteína nos cloroplastos, enquanto que a tradução no segundo AUG é responsável pelo endereçamento da proteína às mitocôndrias. A análise do contexto para início da tradução revelou que a região em torno do primeiro AUG é mais favorável para a tradução do mRNA de thi1. Além disso, observou-se a presença de uma forte estrutura em "grampo de cabelo" próximo ao segundo códon AUG, indicando um contexto subótimo capaz de interferir na tradução. Estas observações confirmaram os dados obtidos a partir da tradução in vitro na qual a iniciação se dá preferencialmente no primeiro AUG o que pode sugerir uma maior necessidade da proteína nos plastídeos. (AU)

• Processo FAPESP: 99/05644-4 - Caracterização dos mecanismos de controle da expressão gênica de THI1 e suas implicações na localização final da proteína no interior da célula
• Beneficiário: Sabrina Moutinho Chabregas
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado