Conflito entre replicação e transcrição: análise da forquilha de replicação em células de Trypanosoma brucei que apresentam a maquinaria de transcrição estagnada no genoma

Resumo

Nosso laboratório estuda a replicação do DNA em tripanossomas, agentes etiológicos da doença de Chagas (Trypanosoma cruzi) e da doença do sono (Trypanosoma brucei). Neste sentido, pretendemos, por um lado, agregar informações à biologia destes organismos bastante peculiares, que divergiram cedo na linhagem eucarionte. Por outro lado, gerar dados que possam vir a ser utilizados na profilaxia e terapia destas doenças. Várias evidências sugerem que existem conflitos entre os complexos que replicam o DNA e aqueles que transcrevem o mesmo DNA molde. Estes conflitos podem levar ao bloqueio da replicação e a instabilidade genômica. Para driblar estes conflitos as células protegem-se de duas maneiras distintas. A primeira é evitando que as maquinarias de transcrição e replicação se encontrem no mesmo DNA molde. A segunda maneira é contando com proteínas capazes de retirar do genoma a maquinaria de transcrição estagnada a fim de não comprometer a duplicação do DNA e consequentemente a estabilidade do material genético. Este projeto pretende verificar se em T. brucei a atividade do replissomo fica comprometida quando a RNA polimerase está estagnada no genoma. Para tanto, será utilizada a técnica SMARD (Single Molecule Analysis of Replicated DNA), já padronizada em nosso laboratório. Nesta técnica, as moléculas de DNA que estão sendo replicadas são marcadas em dois pulsos consecutivos com análogos distintos de timidina, permitindo a visualização de origens de replicação. Mais que isto, é possível verificar a extensão das forquilhas irmãs. Quando o DNA está igualmente duplicado em ambos os sentidos a partir da origem de replicação estas forquilhas são moléculas simétricas. É possível também inferir a velocidade da forquilha de replicação nas células analisadas. Assim, a forma sanguicola de T. brucei, que apresenta o gene CSB silenciado por RNAi e portanto não é capaz de retirar a maquinaria de transcrição estagnada no genoma, será comparada com a célula controle (expressão normal do gene CSB) em relação a: (I) velocidade média das forquilhas de replicação e (II) número de forquilhas de replicação simétricas em relação a forquilhas de replicação assimétricas (que correspondem a replissomos comprometidos).(AU)