Poderiam os pirofosfatos de inositol terem influenciado o desenvolvimento do parasitismo dentro dos cinetoplastídeos?

Resumo

Pirofosfatos de inositol (e.g., IP7 e IP8) são metabólitos envolvidos em uma ampla gama de processos celulares, como recombinação homóloga, patogenicidade microbiana, entre outros. Contudo, o mecanismo de ação e o envolvimento destes metabólitos em possíveis vias espécie-específicas ainda são questões abertas. IP7 e IP8 são sintetizados por meio de vias complementares que envolvem as quinases IP6K e PP-IP5K, respectivamente. Parasitos tripanossomatídeos (ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae), como por exemplo Trypanosoma cruzi e Leishmania spp., possuem genes ortólogos para IP6K, mas os genes que codificam para PP-IP5K ainda não foram identificados no genoma destes organismos. Ou seja, aparentemente estes parasitos não sintetizam IP8 via PP-IP5K, o que os torna excelentes modelos para o estudo dos pirofosfatos de inositol. Curiosamente, resultados preliminares de nosso grupo evidencia que Bodo saltans (um organismo cinetoplastídeo de vida livre) possui um gene ortólogo a PP-IP5K com 42% de identidade em relação a PP-IP5K humana. Deste modo, o principal objetivo deste estudo é investigar se a ausência hipotética de PP-IP5K é mutuamente exclusiva em relação ao parasitismo desenvolvido por alguns organismos dentro da ordem Kinetoplastida. Para isso, realizamos análises in silico usando as quinases IP6K e PP-IP5K para confirmar a suposta ausência de PP-IP5K. Utilizando os softwares MUSCLE, TRIMAL, PHYML, MEGA X e HMMER, reconstruímos árvores filogenéticas e obtivemos evidências preliminares que apontam para a ausência de ortólogos de PP-IP5K em todos os tripanossomatídeos, exceto Paratrypanosoma confusum. Predições das estruturas terciárias sugerem que o domínio catalítico da PP-IP5K de P. confusum, embora tenha 44% de identidade com a PP-IP5K humana, possui uma estrutura incomum, o que coloca sua anotação em xeque. Estes achados preliminares sugerem que a transição de um estilo de vida livre para um estilo de vida parasitário resultou na perda de PP-IP5K. Os próximos passos para atingir o objetivo deste projeto envolvem a inclusão do gene da PP-IP5K de Bodo saltans (BsPP-IP5K) em T. cruzi e Leishmania spp. utilizando plasmídeos específicos (knock-in episomal). Alternativamente, poderemos utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para introduzir o gene BsPP-IP5K em um locus gênico constitutivo (por exemplo ²-tubulina). Após confirmação por PCR, qPCR e western blot, realizaremos diluições clonais para seleção de populações homogêneas. Em seguida, pretendemos realizar uma caracterização fenotípica das linhagens geradas, e.g., avaliar a presença de IP8, proliferação e ciclo celular, além de avaliar a capacidade infectiva e reparo de DNA utilizando células hospedeiras selvagens (WT) e knockout (KO) para PP-IP5K. Os ensaios de infecção utilizando células hospedeiras KO para PP-IP5K permitirão avaliar se T. cruzi ou Leishmania utilizam IP8 do hospedeiro durante a infecção. Assim, este projeto irá esclarecer de maneira inédita se os PP-IPs têm alguma relação com o parasitismo desenvolvido por alguns cinetoplastídeos, contribuindo significativamente para a compreensão da função destes metabólitos que parecem ser importantes em diversas vias.