Análises bioquímicas e biofísicas do efeito dos compostos derivados de lignina na atividade de celobiohidrolases

Resumo

Biorrefinarias operando a alta carga de sólidos são imprescindíveis para consolidar e melhorar a produção de etanol 2G. Nesse processo o aumento do conteúdo de lignina residual e compostos derivados de lignina (LRC, sigla em inglês) tem um efeito negativo na sacarificação enzimática da biomassa. Em resultados preliminares do projeto de Doutorado, o efeito negativo dos LRCs na atividade de várias celobiohidrolases (CBHs) foi confirmado, porém, uma investigação mais profunda em relação aos mecanismos de inibição e a interação desses compostos com CBHs é necessário. Nessa proposta de estágio internacional (BEPE), o efeito inibitório dos LRCs em CBHs será avaliado por ensaios de cinética e métodos biofísicos. Serão avaliadas as CBHs recombinantes de Phanerochaete chrysosporium (PcCel7C e PcCel7D) e CBHs contendo diferentes afinidades pelo substrato e mutações estruturais que possam interferir nos mecanismos de inibição. As enzimas serão fornecidas pelo Prof. Peter Westh da DTU, que possui colaboração com a companhia dinamarquesa Novozymes (Novozymes A/S, Bagsværd, Denmark). As enzimas purificadas serão cineticamente caracterizadas na presença dos LRCs para elucidar os mecanismos de inibição e explorar se as diferentes propriedades das CBHs interferem nesses mecanismos. A CBH I do fungo celulolítico modelo Trichoderma reesei (TrCel7A) será utilizado como controle nos experimentos. Além disso, a estabilidade da proteína e cinética de complexação serão avaliados por calorimetria de varredura diferencial (DSC, sigla em inglês) e fluorescência do triptofano durante a adição dos LRCs. Esses ensaios biofísicos irão fornecer informações sobre a natureza da interação entre a enzima e os LRCs, em que, conjuntamente com a estrutura tridimensional das CBHs, e os dados cinéticos, irão guiar para identificar os padrões de enzimas tolerantes aos LRCs e traçar estratégias para o engenheiramento das enzimas para melhor tolerância à lignina presente na biomassa. (AU)