Clonagem e expressão da fosfolipase A2-CB do veneno da serpente Caudisona durissa terrificus e avaliação da sua atividade antidengue e antifebre amarela

Resumo

O vírus da dengue (DENV) e o da febre amarela (YFV) pertencem ao gênero Flavivirus, família Flaviviridae, e representam importantes arbovírus causadores de doença em humanos. Embora exista uma vacina contra o YFV, ainda são notificados muitos casos de febre amarela nas regiões endêmicas das Américas e, principalmente, da África. Não existem agentes terapêuticos para tratamento da infecção contra nenhum desses vírus. Portanto, estudos para identificação de fármacos para combaterem a dengue e a febre amarela são de suma importância. Nosso grupo descreveu recentemente a ação antiviral da fosfolipase A2 crotoxina B (PLA2-CB) da serpente Caudisona durissa terrificus, a qual tem ação nas fases iniciais do ciclo de replicação do YFV e do DENV. Este projeto tem como objetivo clonar e expressar as duas isoformas da PLA2-CB e avaliar a sua atividade anti-DENV e anti-YFV. As sequências que codificam as isoformas da PLA2-CB serão inseridas em um vetor plasmidial de expressão que será utilizado para transformar células E. coli competentes, as quais serão induzidas a expressar as proteínas recombinantes. Após confirmação e purificação, as isoformas recombinantes da PLA2-CB serão utilizadas em ensaios antivirais. A ação antiviral das PLA2s será avaliada in vitro pela técnica de placas de lise (inibição da replicação viral). A atividade antiviral será medida pelo cálculo do índice de seletividade (IS), que é a razão entre os valores da concentração citotóxica a 50% da monocamada celular (CC50) e a concentração que inibe 50% da infecção viral (CE50). A fim de identificar quais os sítios da molécula da PLA2-CB estão diretamente envolvidos na sua atividade antiviral, mutagêneses sítio-dirigidas serão realizadas. (AU)