Suplementação com gordura e/ou substâncias antioxidantes, ou sexagem por citometria de fluxo e seus efeitos na viabilidade espermática em bovinos

Resumo

Esta proposta refere-se a dois estudos independentes relacionados a fatores (nutrição e sexagem espermática) que interferem na viabilidade do sêmen bovino. A criopreservação de sêmen é de fundamental importância para a expansão das técnicas reprodutivas como a IA, TE e FIV, entretanto pode levar a estresse oxidativo da célula espermática. Deste modo, esta deve possuir membrana plasmática com adequada fluidez que é garantida, entre outros fatores, pelos ácidos graxos poli-insaturados e suporte de defesa antioxidante para incrementar a sobrevivência celular após a congelação. No intuito de tornar espermatozóides mais resistentes à criopreservação, no estudo envolvendo aspectos nutricionais, 40 touros das raças Canchim e Nelore serão suplementados com gordura protegida e/ou vitamina C e selênio durante 70 dias. Neste período, colheitas e congelação de sêmen serão realizadas com intervalo de 14 dias. No sêmen fresco e após congelação/descongelação, serão realizadas diversas avaliações, tais como: vigor, turbilhonamento, concentração e motilidades progressiva e total, além de outros exames complementares: aglutinação de cabeça em contraste de fase, integridade de membrana plasmática com iodeto de propídeo e diacetato 6-carboxifluoresceína (C-FDA), integridade de acrossoma (Peannut aglutinin-PNA e iodeto de propídeo), capacitação espermática com hidroclorido de clortetraciclina (CTC), integridade de cromatina e morfometria espermática com azul de toluidina por meio de análise computadorizada. Além disso, sangue será colhido para posterior dosagem de testosterona, concentração de selênio e atividade da enzima glutationa peroxidase. O objetivo do estudo com sêmen sexado é comparar diferentes características espermáticas entre sêmen sexado e não sexado e embriões produzidos com sêmen de ambos os grupos. Para isto, um ejaculado de cada touro (n=4) da raça Nelore, será colhido e fracionado em três partes: não sexado (NS), sexado contendo cromossomo X (SX) ou cromossomo Y (SY). Para avaliação morfométrica da cabeça do SX vs. SY e pool de SX e SY vs. NS serão feitas 100 imagens de células por amostra de todos os touros/tratamento por meio de microscopia de força atômica. As imagens serão avaliadas em software SPM Off-line quanto às medidas uni, bi e tridimensionais e quanto aos descritores de forma, totalizando 28 variáveis. Padrão de metilação do DNA será avaliado na região diferencialmente metilada (DMR) do gene IGF2 e IGF2R. Todo o procedimento será repetido três vezes. Embriões produzidos in vitro com este sêmen dos três tratamentos serão utilizados para avaliação do padrão de metilação e expressão gênica. Quatro pools de 12 embriões de cada grupo serão formados para avaliação da expressão de diversos genes, tais como, PLAC-8, KRT-8, Interferon-tau, MnSOD, Hsp-70, DNMT 3A, DNMT 3B, DNMT 1, Glucose Transporter (GLUT) 1, 2 e 3 por PCR em tempo real. Do mesmo material será extraído DNA genômico para avaliação do padrão de metilação da DMR do gene IGF2 e IGF2R. Além disto, será realizada a comparação entre os grupos quanto à capacidade de ligação dos espermatozóides sexados e não sexados com as células da tuba uterina, também realizada em três diferentes repetições. O tempo de viabilidade do espermatozóide SX, SY e NS em meio de fecundação também será avaliado. (AU)