Construção e caracterização fenotípica de cepas mutantes de Streptococcus mutans de genes relacionados à sua virulência

Resumo

A cárie dental é uma doença infecciosa e multifatorial, biofilme dependente, que tem como principal agente etiológico o Streptococcus mutans. Este microrganismo tem sua virulência baseada na capacidade de formação de biofilme que se adere à superfície dental, produção de ácidos e sobrevivência em meio ácido. O fato do S. mutans conseguir emergir como flora dominante no biofilme dental mesmo sob condições de estresse faz que ele seja alvo de inúmeras pesquisas. Sabe-se que o sistema Clp (Protease caseinolítica dependente de ATP) detém o papel central na tolerância desse microrganismo frente ao estresse, uma vez que desempenha um importante papel na homeostase celular, e tem a capacidade de controlar a estabilidade de proteínas reguladoras. Além disso observou-se que a proteína Spx serve de substrato para o sistema proteolítico Clp. Assim, foi feita uma detalhada caracterização fenotípica de Spx, que se mostrou como um regulador global, capaz de regular a transcrição de muitos outros genes que são conhecidamente relacionados ao estresse em S. mutans e outros ainda hipotéticos. Assim, o objetivo deste projeto será de dar continuidade a linha de pesquisa em andamento por meio da construção e caracterização fenotípica, in vitro e in vivo, de mutantes de S. mutans com deleção de genes hipotéticos que apresentaram expressão alterada nas mutantes dos genes spxA e spxAB. Para isso, serão construídas as mutantes dos genes selecionados, smu144c, smu1116c e smu1784c, que apresentaram expressão alterada nas mutantes dos genes spxA e spxAB e são fortes candidatos a serem genes relacionados com sobrevivência de S. mutans ao estresse e sua construção será confirmada. Será feita a análise transcricional dos genes selecionados frente ao estresse ácido e oxidativo através de PCR em tempo real (RT-qPCR), além disso as mutantes construídas serão caracterizadas fenotipicamente por meio da avaliação da sua susceptibilidade, sobrevivência e crescimento sob condições de estresse ácido e oxidativo. Serão feitos também testes enzimáticos, avaliando a atividade de enzimas que têm um papel de proteção contra danos oxidativos, são estas a NADH peroxidase (Nox), glutationa oxidorredutase (Gor) e Superóxido dismutase (Sod). E, por fim, as mutantes serão analisadas quanto à sua capacidade de infecção em modelos animais (Infecção em Galleria mellonella e experimento de cárie em ratos). Espera-se com este trabalho que, por meio de uma caracterização fenotípica, sejam identificados novos genes que são regulados por Spx e relacionados com estresse oxidativo em S. mutans, para facilitar o entendimento dos mecanismos pelos quais este microrganismo é capaz de sobreviver em situações de estresse.