Construção e caracterização fenotípica de cepas mutantes de Streptococcus mutans de genes relacionados à sua virulência

Autor(es)

Lívia Câmara de Carvalho Galvão

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Piracicaba, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Odontologia de Piracicaba
• Data de defesa: 2016-02-26

Membros da banca

Pedro Luiz Rosalen; Marcia Pinto Alves Mayer; Maria Regina Lorenzetti Simionato; Sonia Maria Fernandes Fitts; Bruno Bueno Silva

• Orientador: Gilson Cesar Nobre Franco; Pedro Luiz Rosalen

Resumo

O fato de Streptococcus mutans conseguir emergir como microrganismo dominante no biofilme dental mesmo sob condições de estresse faz com que ele seja alvo de múltiplos interesses não apenas para a saúde oral, mas também para a saúde sistêmica. O sistema proteolítico Clp (Protease caseinolítica dependente de ATP) detém o papel central na tolerância desse microrganismo frente ao estresse ambiental, por desempenhar um importante papel na homeostase celular e controlar a estabilidade de proteínas reguladoras. Além disso, observou-se que a proteína Spx serve de substrato para esse sistema Clp e por isso foi feita uma detalhada caracterização fenotípica de Spx, regulador global, capaz de regular a transcrição de muitos genes conhecidamente relacionados ao estresse oxidativo em S. mutans e outros genes ainda hipotéticos. Assim, o objetivo deste trabalho foi construir e caracterizar fenotípicamente, in vitro e in vivo, cepas mutantes de S. mutans UA159 com deleção de genes hipotéticos, que apresentaram expressão alterada nas mutantes dos genes spxA1 e spxA1spxA2. Foram construídas as mutantes dos genes selecionados: smu143c smu144c, smu247, smu248, smu540, smu569, smu570, smu929, smu1296, smu1497 e smu1685, hipotéticos e regulados por Spx. Foi feita a análise transcricional dos genes selecionados frente ao estresse oxidativo através de PCR quantitativo (RT-qPCR). As mutantes construídas foram caracterizadas fenotipicamente por meio da avaliação da sua susceptibilidade, sobrevivência e crescimento sob condições de estresse ácido, oxidativo, em presença de ferro e outros metais. Em acréscimo, foi feita uma avaliação quanto à capacidade de formação de biofilme em meio com sacarose e esses genes foram avaliados por meio de ensaio de transcrição in vitro de forma a confirmar a sua regulação direta ou indereta por Spx . As cepas selecionadas por apresentarem fenótipo que justificasse relação com estresse oxidativo foram também investigadas quanto a capacidade de colonização em modelo animal sujeito a alto desafio cariogênico. Além disso, foi pesquisada a capacidade de cepas mutantes de Spx em causar lesões cariosas em ratos e seu papel regulatório como ativador de competência, na capacidade de formar mutacinas, biofilmes e glucanos a partir de sacarose. Além disso, a cepa mutante smu1784c, também regulada por Spx, foi submetida a uma caracterização inicial em busca de fenótipos que justifiquem sua relação com o gene eep de Enterococcus faecalis ou com estresse oxidativo em S. mutans. Com este trabalho, por meio de uma caracterização fenotípica detalhadas de novos genes regulados por Spx pôde-se relacioná-los ao estresse oxidativo em S. mutans, além de que verificou-se relação desses genes e de Spx com a homeostase de ferro. Pôde-se confirmar o papel de Spx na patogênese da doença cárie e virulência do S. mutans uma vez que as mutantes dos genes spxA1 e spxA2 reduziram a formação de cárie em modelo animal, mostraram-se menos competentes e spxA1 mostrou-se incapaz de produzir mutacinas. E o gene smu1784c, também regulado por Spx, mostrou-se envolvido com respostas ao estresse ácido e oxidativo e na virulência de S. mutans, uma vez que a cepa mutante mostrou-se atenuada em modelo de Galleria mellonella e capaz de reduzir os parâmetros bioquímicos relacionados à formação de biofilme. Portanto, esses achados confirmam e elucidam o papel regulador de Spx, possibilitando a identificação de novos alvos terepêuticos para a prevenção/tratamento de doenças envolvendo este microrganismo (AU)

• Processo FAPESP: 12/02278-3 - Construção e caracterização fenotípica de cepas mutantes de Streptococcus mutans de genes relacionados à sua virulência
• Beneficiário: Lívia Câmara de Carvalho Galvão
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado