Hexamerinas de Apis mellifera: interação entre as subunidades, com o hormônio juvenil e com estruturas e proteínas nucleares

Resumo

As hexamerinas são ativamente sintetizadas pelo corpo gorduroso de larvas de insetos e secretadas na hemolinfa, onde são estocadas. Durante a metamorfose estas proteínas retornam ao órgão de origem para serem processadas e utilizadas como fontes de aminoácidos para a reconstrução dos tecidos do inseto adulto. Em certas espécies de insetos, podem também servir como fontes de aminoácidos para a produção de ovos. No entanto, há evidências circunstanciais de que as hexamerinas têm funções adicionais no desenvolvimento de A. mellifera. Dois conjuntos de dados de nosso Laboratório (Laboratório de Biologia do Desenvolvimento de Abelhas - LBDA) apontam nesta direção. O primeiro deles se refere à relação entre a expressão dos genes de hexamerinas e o título de hormônio juvenil (HJ), o qual tem função essencial na diferenciação de castas e metamorfose. Análises in silico das UTRs (untranslated regions) dos quatro genes codificadores de hexamerinas identificaram sítio de ligação para a proteína USP (Ultraspiracle protein) que, com outras proteínas reguladoras, integra o receptor nuclear do HJ. Em reforço à hipotética funcionalidade do elemento de resposta a USP, nossos experimentos de manipulação hormonal in vivo, seguidos de quantificação dos transcritos por RT-PCR em tempo real, mostraram que os genes de hexamerinas são positivamente regulados por HJ. Por outro lado, os perfis quantitativos contrastantes dos níveis de transcritos de hexamerinas e dos títulos de HJ sugerem que estas proteínas agem como proteínas ligadoras deste hormônio e, nesta função, controlam seu título e sua ação. Em conjunto, estes dados sugerem um mecanismo de regulação por feedback em que hexamerinas são induzidas pelo aumento do título de HJ, mas também se ligam a este hormônio inativando-o. Se assim for, as hexamerinas teriam função crítica nos processos de desenvolvimento regulados por HJ, incluindo a diferenciação de castas e a metamorfose. O segundo conjunto de resultados, obtidos por imunofluorescência e microscopia confocal, evidenciou que as hexamerinas não se localizam somente no citoplasma, mas também nos núcleos de células do corpo gorduroso em metamorfose e das gônadas em desenvolvimento. Este resultado surpreendente sugere que as hexamerinas têm função reguladora ou estrutural nos núcleos das células destes tecidos. Tendo estes conjuntos de resultados como suporte, e também os dados de experimentos-pilotos, onde obtivemos êxito em inserir os genes codificadores de cada hexamerina em bactérias para produção in vitro das respectivas subunidades, estamos agora propondo novas abordagens experimentais visando a caracterização funcional destas proteínas. Com esta finalidade, o presente projeto propõe a utilização de (1) marcadores de estruturas e proteínas nucleares para esclarecer a localização sub-nuclear das hexamerinas; (2) calorimetria para investigação da interação molecular entre as subunidades de hexamerinas e entre elas e o HJ (o que exige a prévia produção in vitro destas subunidades, em quantidades suficientes); (3) silenciamento pós-transcricional mediado por RNAi para verificação da função de cada hexamerina na metamorfose (desenvolvimento pupal e adulto-farato) e (4) CHIP-Seq para investigar se as hexamerinas funcionam como proteínas reguladora e, se assim for, para caracterizar os respectivos sítios de ligação ao DNA. Estas abordagens foram delineadas para propiciar um avanço na caracterização funcional das hexamerinas.