Caracterização das concentrações de hormônio anti-Mülleriano - AMH in vivo e in vitro em cadelas e lobas cinza (Canis lupus baileyi)

Resumo

Objetivo do presente estudo é caracterizar as concentrações de hormônio anti-mülleriano - AMH in vivo em cadelas e lobas cinza (Canis lupus baileyi) e in vitro em cadelas. Para tanto serão realizados dois experimentos: Experimento 1: Determinação dos níveis hormonais séricos de hormônio anti-muleriano em cadelas e lobas cinza. Serão utilizadas 10 fêmeas de lobo cinza comum, mantidas no Centro Internacional de Lobos (Minessota, EUA), como modelo experimental para as fêmeas de lobo mexicano cinza. Todas as lobas terão seu sangue coletado duas vezes, uma durante a sua estação reprodutiva (inverno) e outra durante o anestro (verão). O número de animais a serem utilizados pode aumentar ao longo do experimento. Para os cães domésticos serão coletadas, na FMVZ, UNESP (Campus de Botucatu) uma única amostra de sangue, de 45 fêmeas divididas em 3 grupos experimentais: pré-púberes (n=15), púberes (n=15) e idosas (n=15). As amostras de sangue serão centrifugadas e o soro armazenado a -20ºC até a realização das análises. Dosagens de AMH e estrógenos séricos serão realizadas. Os dados obtidos serão tabulados e ou descritos e testes estatísticos adequados serão realizados. Experimento 2: Produção de AMH em cultura in vitro de ovários frescos e após descongelação de cadelas. Pelo menos 20 cadelas serão castradas, e uma amostra de sangue de cada animal será coletada para posterior dosagem hormonal. Os ovários serão isolados, identificados e armazenados em containers térmicos (Equitainer®) a 37ºC. Os ovários sem CL terão seu córtex fatiado. Três fragmentos frescos serão destinados ao cultivo in vitro, um fragmento fresco será processado para posterior análise histológica e os outros quatro fragmentos serão criopreservados, para posterior cultivo in vitro. O método de criopreservação utilizado nesse projeto é o mesmo para o armazenamento de ovários de fêmeas de lobo mexicano cinza. Para a descongelação, as amostras de uma mesma fêmea serão imersas imediatamente em uma placa Petri contendo solução de descongelação (SD) e depois serão transferidas para uma placa contendo solução de sucrose a 0,5M (SS). As amostras frescas e descongeladas serão fatiadas em pedaços menores e serão transferidas para placas de 96 poços contendo 400 µL de solução de crescimento folicular (GM). As placas serão mantidas a 5% CO2 a 38,5°C, a cada dois dias 200 µL de meio serão removidos e armazenados em criotubos a -20ºC para dosagens de AMH, estradiol e progesterona. O mesmo volume de meio fresco será adicionado aos poços. Após 7 dias de cultura in vitro, as amostras serão removidas e processadas para análise histológica. As dosagens de estrógeno e progesterona das amostras provenientes do cultivo in vitro serão realizadas utilizando kits comerciais para técnica de radioimunoensaio, no laboratório de endocrinologia do Zoológico de Saint Louis. (AU)