Caracterização molecular de RNAs teloméricos não codificadores em Leishmania major

Resumo

Protozoários do gênero Leishmania pertencem à família Trypanosomatidae, e apresentam características biológicas peculiares e incomuns a outros eucariotos. Muitas espécies deste gênero são conhecidos por produzir uma grande variedade de doenças conhecidas como leishmaniose as quais são transmitidas por um inseto do gênero fleobotomínio. Esta doença tem um grande espectro de formas clínicas e no Brasil aparecem muitos casos novos por ano, principalmente devido às condições sócio-econômicas da população, desnutrição, deslocamento da população, mudanças ambientais e mudanças climáticas. Até o momento não existe nenhuma vacina ou tratamento eficientes para as diferentes formas da leishmaniose humana e os fármacos disponíveis, tem alto custo ou induzem a toxicidade e desenvolvimento de resistência dos parasitos. Estudos que contribuam com o entendimento da biologia molecular e fisiologia da Leishmania fornecem uma possibilidade de encontrar novos alvos terapêuticos como é o caso dos telômeros, cuja função principal é manter a estabilidade do genoma que se perturbada pode afetar diretamente a proliferação ou multiplicação dos parasitos. Os telômeros de Leishmania, como da maioria dos eucariotos são estruturas nucleoprotéicas formadas por interações entre proteínas e por DNA repetitivo (5'-TTAGGG-3'), localizados nos extremos dos cromossomos. São responsáveis por proteger os cromossomos da degradação, recombinação e fusão terminal, assegurando que a informação genética seja corretamente copiada durante a duplicação celular. Eles são mantidos por ação da telomerase e seu tamanho é regulado por diversos processos entre os quais se encontra a ação de alguns longos RNAs não codificadores (LncRNA). Entre os LncRNAs com função telomérica estão o TER (Telomerase RNA) o qual é o principal componente do complexo telomerase, pois carrega o molde da repetição telomérica que é copiada pela telomerase durante a replicação dos telômeros. Outro LncRNA é o TERRA (Telomere Repeat containing RNA) e seus variantes, os quais estão envolvidos na regulação do comprimento e replicação do telômeros, na resposta a danos no DNA telomérico, nas mudanças na composição da cromatina telomérica entre outros. Em Leishmania nós identificamos e caracterizamos parcialmente o TER (LeishTER, Leishmania telomerase RNA), e neste trabalho pretendemos verificar se o efeito de seu knockdown e de sua superexpressão in vivo, alteram suas interações com o componente TERT (Telomerase reverse transcriptase) e afeta os telômeros do parasita. Em relação a expressão de TERRA e/ou seus variantes em Leishmania, embora se saiba a mais de duas décadas que os telômeros de diferentes tripanosomatídeos, incluindo Leishmania, são transcritos por diferentes RNA polimerases, não está claramente definido o sítio de início da transcrição e de qual fita telomérica os transcritos são gerados. Sendo assim, neste projeto realizaremos análises in silico em busca de potenciais candidatos a TERRA em bibliotecas de RNA-seq, assim como iremos validar os mesmos utilizando northern blot, RT-PCR e RNA-FISH. As possíveis funções de ambos LncRNA teloméricos serão estudadas nas duas formas de desenvolvimento do parasita e no ciclo celular de formas promastigotas. (AU)