Dinâmica da replicação do DNA em Trypanosoma cruzi: caracterização do licenciamento e da taxa de replicação

Resumo

Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado, pertencente à família Trypanosomatidae, e agente etiológico da doença de Chagas, uma doença neglicenciada que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Para sobreviver, este parasito necessita replicar adequadamente seu DNA e isso envolve a ação coordenada de um complexo de variadas proteínas. A replicação do DNA inicia-se com o licenciamento de uma maquinaria de pré-replicação (pré-RC) em regiões específicas do DNA denominadas origens de replicação. A dinâmica e as proteínas envolvidas na maquinaria pré-RC ainda não estão bem definidas nos tripanosomatídeos. Deste modo, pretendemos identificar e caracterizar possíveis interatores da proteína TcOrc1/Cdc6, a qual é responsável pelo reconhecimento e ativação de origens de replicação em T. cruzi. Para tal, pretendemos realizar ensaios de captura (imunoprecipitação e co-imunoprecipitação), identificar os possíveis interatores em SDS-PAGE e espectrômetro de massas, e confirmar suas funções na replicação através de knockout em T. cruzi. Em paralelo, pretendemos realizar ensaios de pull down utilizando TcOrc1/Cdc6 recombinante marcada com diferentes tags (6xHis e Maltose Binding Protein - MBP) para verificar se esta proteína oligomeriza. Em caso positivo, esta oligomerização será confirmada in vitro por ultracentrifugação analítica e in vivo utilizando parasitas transfectados com TcOrc1/Cdc6 contendo diferentes caudas. Além disso, pretendemos também avaliar o quanto os processos de metabolismo de DNA (transcrição e reparo) influenciam a taxa de replicação em T. cruzi. Para isto iremos inibir a transcrição (utilizando ±-manitina) e causar danos no DNA (utilizando radiação U.V. e tratamento com H2O2) e verificar, através da técnica denominada SMARD (Single Molecule Analisys of Replicated DNA), se a taxa de replicação das forquilhas é alterada. Vale ressaltar que este conhecimento poderá auxiliar futuras estratégias antiparasitárias, já que a replicação do DNA está diretamente relacionada à manutenção cromossômica e viabilidade celular. (AU)