Origens da replicação em tripanossomas

Resumo

ORIGENS DA REPLICAÇÃO EM TRIPANOSSOMAS 1(1-2) Origens de replic. em tripanossomas e sua posição em nucleossomos durante o ciclo de vida de T.cruzi. Replic. cromossômica inicia com a montagem do complexo de pré-replic.(pré-RC)em sítios de DNA ao longo dos cromossomos, q são chamados de origens de replicação1. Os genomas da maioria das células eucarióticas são replicados a partir de muitas origens de replic. durante a fase de síntese do S do ciclo celular. Este proc. requer que as células devam garantir que 1 nº suficiente de origens são usados em cada fase S, s/a reutilização de qualquer origem em 1 único ciclo celular. Ao contrário de outros eucariotos, pouco se sabe sobre o processo de replic. do DNA em tripanossomas, protozoários parasitas q aparecem no início da evolução. Este projeto pretende identificar origens de replic. em T.cruzi e T.brucei, agentes etiológicos de Chagas e Doença do Sono,respectiva/e. Algumas seqüências obtidas serão verificadas como origens de replic. de fato usando ensaios de SMARD e ChIP.2(3-4) Origens de replic. em tripanossomas e sua posição em nucleossomos durante o ciclo de vida de T.cruzi. O ciclo de vida do T.cruzi alterna em estágios ñ-replicativos e replicativos. Bases moleculares q controlam a falta de replic. de DNA na fase ñ-replicativa ainda ñ foram determinadas. Já se mostrou q em eucariotos as origens de replic. estão localizadas em regiões ñ-nucleossomais. Identificadas as origens de replic. em T.cruzi, investigaremos como essas seqüências são organizadas,relativas à posição nucleosomal, em estágios do ciclo de vida de T.cruzi. Desta forma,os DNAs genômicos serão digeridos com nuclease de Micrococcus, q digere todos os DNA livres nucleossomais,e o DNA protegido nucleossomal será sequenciado.3(5):Maquinário de pré-replic.de tripanossomas de DNA. Replic.cromossômica se inicia com a montagem do complexo de pré-replic.(pré-RC)em sítios de DNA ao longo dos cromossomos, chamados de origens de replication1. Em eucariotos,o pré-RC é composto por 1 complexo de reconhecimento de origem(ORC),contendo as moléculas Orc1-Orc6,2 proteínas denominadas Cdc6eCDT1, e a manutenção do complexo de mini-cromossomo(MCM), o qual é composto de moléculas de Mcm2-MCM7. Eqto. o pré-RC composto de ORC1-6, Cdc6, CDT1 e MCM2-7 é organizado na cromatina, origens passa a estar apta para replicar. Além disso, outras proteínas devem associar-se com a origem antes da iniciação bem sucedida de síntese de DNA. A ligação de fatores de regulação e os componentes da forquilha de replic. do DNA permite o desenrolamento da origem, o recrutamento de polimerases de DNA replicativa e, por fim,o estabelecimento da forquilha de replic.2, 3. Ao contrário de outros eucariotos, pouco se sabe sobre o processo de replic. do DNA em tripanossomas, parasitas protozoários q aparecem no início da evolução. Como os tripanossomatídeos têm características peculiares, com seus genes transcritos em unidades policistrônicas e processados por 1 reação de trans-splicing e com expressão gênica controlada principal/e a nível pós-transcricional4-6, a hipótese é de q novas estratégias para lidar com a regulação da replic. podem ser encontradas nesses organismos. Bancos de dados genômicos de tripanossomatídeos mostram q estes organismos contêm todas as moléculas MCM, mas ñ contêm sequências em seu genoma q poderiam codificar para as subunidades ORC,Cdc6 ou CDT1. Tripanossomas têm 1 gene para apenas 1 das 6 subunidades do ORC,Orc1, q é tbém homólogo a Cdc6. Ele é anotado como Orc1 7 e o nomeamos Orc1/Cdc6. Resultados anteriores do nosso grupo mostraram q Orc1/Cdc6 é de fato 1 componente de maquinário de pré-replic. q poderia estar envolvido na seleção das origens de replic. nestes organismos8. Usando técnicas inversas genéticas (RNAi, expressão de proteínas de tag),e ensaios moleculares e celulares convencionais, pretendemos (i) buscar moléculas q podem ser componentes do maquinário de pré-replic. e/ou (ii) compreender como é o recrutamento de complexo helicase MCM direta/e pelo Orc1/Cdc6.