Origens da replicação em tripanossomas

Resumo

ORIGENS DA REPLICAÇÃO EM TRIPANOSSOMAS 1(1-2)Origens de replic.em tripanossomas e sua posição em nucleossomos durante o ciclo de vida de T.cruzi Replic.cromossômica inicia com a montagem do complexo de pré-replic.(pré-RC)em sítios de DNA ao longo dos cromossomos, q são chamados de origens de replicação1.Os genomas da maioria das células eucarióticas são replicados a partir de muitas origens de replic. durante a fase de síntese do S do ciclo celular.Este proc. requer que as células devam garantir que 1 nº suficiente de origens são usados em cada fase S, s/a reutilização de qualquer origem em 1 único ciclo celular.Ao contrário de outros eucariotos,pouco se sabe sobre o processo de replic.do DNA em tripanossomas,protozoários parasitas q aparecem no início da evolução. Este projeto pretende identificar origens de replic.em T.cruzi e T.brucei,agentes etiológicos de Chagas e Doença do Sono,respectiva/e.Algumas seqüências obtidas serão verificadas como origens de replic de fato usando ensaios de SMARD e ChIP.2(3-4)Origens de replic.em tripanossomas e sua posição em nucleossomos durante o ciclo de vida de T.cruzi . O ciclo de vida do T.cruzi alterna em estágios ñ-replicativos e replicativos.Bases moleculares q controlam a falta de replic.de DNA na fase ñ-replicativa ainda ñ foram determinadas.Já se mostrou q em eucariotos as origens de replic.estão localizadas em regiões ñ-nucleossomais. Identificadas as origens de replic.em T.cruzi, investigaremos como essas seqüências são organizadas,relativas à posição nucleosomal,em ` estágios do ciclo de vida de T.cruzi.Desta forma,os DNAs genômicos serão digeridos com nuclease de Micrococcus, q digere todos os DNA livres nucleossomais,e o DNA protegido nucleossomal será sequenciado.3(5):Maquinário de pré-replic.de tripanossomas de DNA.Replic.cromossômica se inicia com a montagem do complexo de pré-replic.(pré-RC)em sítios de DNA ao longo dos cromossomos,chamados de origens de replication1.Em eucariotos,o pré-RC é composto por 1complexo de reconhecimento de origem(ORC),contendo as moléculas Orc1-Orc6,2 proteínas denominadas Cdc6eCDT1,e a manutenção do complexo de mini-cromossomo(MCM),o qual é composto de moléculas de Mcm2-MCM7.Eqto o pré-RC composto de ORC1-6,Cdc6,CDT1eMCM2-7 é organizado na cromatina,origens passa a estar apta para replicar.Além disso,outras proteínas devem associar-se com a origem antes da iniciação bem sucedida de síntese de DNA.A ligação de fatores de regulação e os componentes da forquilha de replic.do DNA permite o desenrolamento da origem,o recrutamento de polimerases de DNA replicativa e,por fim,o estabelecimento da forquilha de replic.2, 3.Ao contrário de outros eucariotos,pouco se sabe sobre o processo de replic.do DNA em tripanossomas,parasitas protozoários q aparecem no início da evolução.Como os tripanossomatídeos têm características peculiares, com seus genes transcritos em unidades policistrônicas e processados por 1 reação de trans-splicing e com expressão gênica controlada principal/e a nível pós-transcricional4-6, a hipótese é de q novas estratégias para lidar com a regulação da replic.podem ser encontradas nesses organismos.Bancos de dados genômicos de tripanossomatídeos mostram q estes organismos contêm todas as moléculas MCM,mas ñ contêm sequências em seu genoma q poderiam codificar para as subunidades ORC,Cdc6 ou CDT1.Tripanossomas têm 1 gene para apenas 1 das 6 subunidades do ORC,Orc1,q é tbém homólogo a Cdc6.Ele é anotado como Orc1 7 e o nomeamos Orc1/Cdc6.Resultados anteriores do nosso grupo mostraram q Orc1/Cdc6 é de fato 1 componente de maquinário de pré-replic.q poderia estar envolvido na seleção das origens de replic.nestes organismos8.Usando técnicas inversas genéticas(RNAi, expressão de proteínas de tag),e ensaios moleculares e celulares convencionais,pretendemos (i)buscar moléculas q podem ser componentes do maquinário de pré-replic.e/ou (ii)compreender como é o recrutamento de complexo helicase MCM direta/e pelo Orc1/Cdc6