Função das nucleases MRE11, DNA2 e EXO1 na ressecção do DNA terminal e o reparo das quebras de dupla fita em Trypanosoma brucei

Resumo

As quebras de fita dupla do DNA (DSBs) são uma das formas mais tóxicas do dano no DNA. Estas podem surgir acidentalmente durante o metabolismo normal ou após a exposição a agentes que lesionam o DNA. A falha em repará-los pode resultar em instabilidade genômica, uma característica das células cancerígenas. Nos eucariotos, as DSBs são reparadas por recombinação homóloga (HR) e ligação de extremidades não homóloga (NHEJ). Na HR e ligação das extremidades mediada por microhomologia (MMEJ) (um tipo de NHEJ independente do heterodímero Ku), as cadeias de DNA 5´ das DSBs são degradadas nucleoliticamente através de um processo denominado ressecção. Este processo, que gera DNA de simples fita de extremidades 3´ com diferentes longitudes de homologia, é crítico para a escolha da via de reparo por HR ou MMEJ e sinalização de checkpoint. Na maioria dos eucariotos, o reparo por HR e MMEJ é conservado, incluindo Trypanosoma brucei, o parasita responsável da tripanossomíase humana africana, uma doença que é fatal se não tratada. Neste parasita a ressecção não está definida. Deste modo, nós pretendemos caracterizar a função das principais nucleases na ressecção e reparo das DSBs. Para isto, as nucleases MRE11, DNA2 e Exo1 serão silenciadas em diferentes configurações e tanto a ressecção como o reparo das DSBs geradas pelo tratamento com radiação ionizante ou pela atividade da enzima I-Scel serão avaliadas. Além disto, parâmetros como localização nuclear usando microscopia de fluorescência e ligação a cromatina; longitude e taxa de ressecção usando a análise de molécula única de fitas ressectadas e qPCR e; funções destas nucleases na escolha do reparo (HR ou MMEJ) mediante um sistema reporter, serão avaliadas. Além disto, vamos determinar se existem diferenças na participação destas nucleases na ressecção e reparo de DSBs dependente do ciclo celular. Finalmente, nós vamos caracterizar a função destas nucleases na ressecção de DSBs num locus subtelomérico. (AU)