Contribuição da expressão da caspase-8 e RIPK3, em células alvo, para a sua eliminação in vivo por linfócitos T CD8 antígeno-específicos

Resumo

A direta eliminação de células-alvo por linfócitos T citotóxicos (CTLs) exerce um papel importante na imunidade protetora contra patógenos e células tumorais, e pode ser desencadeada pela ação de perforina e granzima, ou pela interação Fas-FasL. A interação Fas-FasL promove apoptose através da ativação da caspase-8 e posterior clivagem das caspases efetoras -3, -6 e -7, ou de Bid, um membro proapoptótico da família Bcl-2. Recentemente, foi demonstrado que a caspase-8 participa de um outro tipo de morte celular programada, a Necroptose, inibindo a formação do necrosomo (RIPK1-RIPK3-MLKL). Interessantemente, nada se sabe sobre o papel destes componentes centrais da necroptose na resistência/susceptibilidade de células alvo ao ataque por CTL. Além disto, recentemente, tem sido demonstrado uma correlação entre mutações no gene CASP8 em células tumorais de pacientes com alta atividade citolítica, sugerindo que a deficiência em caspase-8 pode representar um mecanismo pelo qual células tumorais evadem a sinalização apoptótica desencadeada por CTLs. Portanto, o objetivo deste projeto é investigar a contribuição relativa da expressão de Casp8 ou RIPK3, em células alvo, para a sua eliminação in vivo por linfócitos T CD8 antígeno-específicos. Para tanto, nosso grupo tem utilizado o adenovírus recombinante humano tipo 5 (hAd5) para estudar respostas imunes in vivo mediadas por células T citotóxicas. Neste sentido, camundongos imunizados ou não-imunizados recebem, por via intravenosa, esplenócitos singênicos marcados com diferentes concentrações de fluorocromos, ou fluorocromos diferentes, e pulsados (alvo) ou não pulsados (controle) com peptídeos cognatos, misturados na razão 1:1. A eliminação específica das células-alvo é avaliada através da análise da citometria de fluxo dos esplenócitos após 18-24h. Para investigar o papel relativo da expressão de caspase-8 e/ou RIPK3, esplenócitos provenientes de camundongos C57BL/6 selvagem, Ripk3-/- ou caspase-8-/-Ripk3-/- serão utilizados como alvo nesse sistema. Além disso, camundongos C57BL/6 selvagens e deficientes em perforina (Prf /-) e FasL (gld) serão utilizados para avaliar a relativa contribuição destas duas vias apoptóticas. Experimentos in vitro serão realizados para complementar os estudos in vivo. Portanto, esse projeto contribuirá para a compreensão do papel da caspase-8 e RIPK3 (necroptose) na resistência de células tumorais à eliminação in vivo por linfócitos T citotóxicos. (AU)