Identificação do sítio de ubiquitinação da proteína mitocondrial TOMM20 pela E3-ubiquitina ligaseSCF(Fbxo7)

Resumo

A Translocase of Outer Mitochondial Membrane 20 (TOMM20) reconhece os sinais de localização mitocondrial de proteínas que serão importadas para o interior da mitocôndria, contribuindo diretamente para a homeostase desta organela. TOMM20 também desempenha um papel importante no processo de mitofagia desencadeado pela despolarização mitocondrial, bloqueando a importação de PINK1, e estabilizando-a na membrana mitocondrial. Nosso grupo de pesquisa em colaboração com a Dra. Heike Laman (Universityof Cambridge/UK) demonstrou que TOMM20 interage in vivo e in vitro com Fbxo7 e que é um substrato do complexo E3 ubiquitinaligase SCF (Fbxo7) sendo mono e poliubiquitinadain vitro e in vivo via lisina 63 (K63). Este é um sinal de regulação de função e não degradação pelo proteassoma e de fato, verificamos que a redução ou aumento da expressão de Fbxo7 levou à redução e aumento nos níveis de TOMM20, respectivamente, indicando uma relação funcional de dependência que não está associada a alteração da estabilidade de TOMM20. Em um estudo de ubiquitinoma de células HEK293T, foi identificado três sítios de ubiquitinação em TOMM20 (K56, K61 e K68), no entanto, não foi descrita qual E3 ligase foi a responsável por essas modificações. Assim, este projeto tem como objetivo avaliar em qual(s) desses resíduos de lisina a E3 ligase SCF(Fbxo7) é capaz de ubiquitinar TOMM20. Para isso, construiremos os mutantes de TOMM20 K56R,K61R e K68R através de mutação pontual e avaliaremos a ubiquitinação destes substratos in vivo através de ensaios de ubiquitinação em células HEK293T. Os resultados deste projeto contribuirão para o entendimento da relação funcional entre TOMM20 e Fbxo7, abrindo perspectivas para a determinação da função desta modificação pós-traducional em TOMM20 nos processos de importação mitocondrial e mitofagia que são objetivos do Auxílio Regular FAPESP vigente intitulado "Caracterização funcional da E3 ubiquitina-ligaseSCF(Fbxo7/PARK15) na via oncogênica Wnt e homeostase mitocondrial " (Processo FAPESP 2016/00792-2) (AU)