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Utilização de microarranjos de proteínas (protoarrays) para identificação de substratos da E3 ubiquitina ligase SCF1 (FBXO25)

Processo: 10/16464-8
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de abril de 2011
Vigência (Término): 31 de janeiro de 2015
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Enzimologia
Pesquisador responsável:Marcelo Damário Gomes
Beneficiário:Felipe Roberti Teixeira
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Bolsa(s) vinculada(s):12/09241-8 - Identificação de substratos da E3 ubiquitina-ligase SCF(Fbxo7) utilizando microarranjo de proteínas, BE.EP.PD
Assunto(s):Substratos

Resumo

A proteína FBXO25 é uma das 70 proteínas do tipo F-box que servem como fatores de especificidade para maior família de E3 ubiquitina-ligases humanas, as do tipo RING (Really Interesting New Gene-BoX 1) oligoméricas denominadas SCF - compostas por Skp1, Cullin1, RBX1 e uma proteína tipo F-box - que estão envolvidas na ubiquitinação de proteínas para degradação via Sistema Ubiquitina Proteassoma (SUP). Menos de 10% das proteínas tipo F-box tem sua função e substratos identificados. Nós mostramos que FBXO25 acumula-se no núcleo celular formando uma nova estrutura subnuclear denominada FANDs (FBXO25 Associated Nuclear Domains) que estão envolvidos na ubiquitinação nuclear. Recentemente, reportamos a identificação de 132 possíveis ligantes de FBXO25 a partir da combinação de duas estratégias proteômicas, TAP (Tandem Affinity Purification) e YTHS (Yeast Two Hybrid System). Um desses, a proteína ²-actina globular interage via C-terminal com o N-terminal de FBXO25 e está enriquecida nos FANDs. A inibição da polimerização de ²-actina promove a desorganização dos FANDs, indicando seu papel na regulação da dinâmica desses corpos. Além disso, anticorpos anti-FBXO25 interferem na transcrição via RNA polimerase II em ensaios de transcrição in vitro. Embora tenhamos avançado nos estudos da funcionalidade de FBXO25 nenhuma das abordagens utilizadas nos permitiu a identificação direta de substratos do complexo SCFFBXO25, o que é fundamental para identificação de sua função como E3 ubiquitina-ligase. Os microarrajnos de proteínas (Protoarrays) possuem mais de 21.000 proteínas humanas imobilizadas direcionalmente em uma lâmina e vem sendo amplamente utilizados na identificação de substratos de uma classe de E3-ligases monoméricas. Não há na literatura nenhum registro do uso de Protoarrays para identificação de substratos de E3-ligases do tipo SCF, devido a dificuldade em se obter esses complexos proteicos ativos. No entanto, em ensaios preliminares de ubiquitinação in vitro sobre os Protoarrays com SCFFXBO25 purificados, obtivemos resultados extremamente promissores, com a identificação de vários alvos ubiquitinados apenas pelo complexo SCFFBXO25 selvagem. No entanto, réplicas e outros controles negativos dos experimentos são necessários para confirmação dos alvos identificados. Somos pioneiros na utilização dessa abordagem proteômica no país e dispomos de uma infra-estrutura e treinamento necessário e suficientes para sua realização. Sendo assim, o presente projeto visa identificar substratos da E3 ubiquitina-ligase SCFFBXO25 utilizando microarranjos de proteínas humanas como ferramenta proteômica.

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
TEIXEIRA, FELIPE R.; MANFIOLLI, ADRIANA O.; VIEIRA, NICHELLE A.; MEDEIROS, ANA CARLA; COELHO, PRISCILA DE O.; GUIMARAES, DIMITRIUS SANTIAGO; SCHECHTMAN, DEBORAH; GOMES, MARCELO D. FBXO25 regulates MAPK signaling pathway through inhibition of ERK1/2 phosphorylation. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 621, p. 38-45, MAY 1 2017. Citações Web of Science: 2.
MARUYAMA, SANDRA R.; GARCIA, GUSTAVO R.; TEIXEIRA, FELIPE R.; BRANDAO, LUCINDA G.; ANDERSON, JENNIFER M.; RIBEIRO, JOSE M. C.; VALENZUELA, JESUS G.; HORACKOVA, JANA; VERISSIMO, CECLIA J.; KATIKI, LUCIANA M.; BANIN, TAMY M.; ZANGIROLAMO, AMANDA F.; GARDINASSI, LUIZ G.; FERREIRA, BEATRIZ R.; DE MIRANDA-SANTOS, ISABEL K. F. Mining a differential sialotranscriptome of Rhipicephalus microplus guides antigen discovery to formulate a vaccine that reduces tick infestations. PARASITES & VECTORS, v. 10, APR 26 2017. Citações Web of Science: 8.
TEIXEIRA, FELIPE ROBERTI; RANDLE, SUZANNE J.; PATEL, SHACHI P.; MEVISSEN, TYCHO E. T.; ZENKEVICIUTE, GRASILDA; KOIDE, TIE; KOMANDER, DAVID; LAMAN, HEIKE. Gsk3 beta and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease. Biochemical Journal, v. 473, n. 20, p. 3563-3580, OCT 2016. Citações Web of Science: 6.

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