Identificação de substratos da E3 ubiquitina-ligase SCF(Fbxo7) utilizando microarranjo de proteínas

Resumo

Fbxo7 é uma proteína associada a duas importantes doenças humanas, câncer e Doença de Parkinson (DP). Ela é uma das 69 proteínas do tipo F-box humanas que servem como fatores de especificidade para maior classe de E3 ubiquitina-ligases conhecidas, as do tipo SCF. Esta holoenzima multissubunidade é composta pelas seguintes proteínas: S-phase-kinase associated protein 1 (SKP1), Really interesting new gene-box 1 (RBX1), Cullin 1 e uma proteína F-box (FB). Dentro desse complexo, as proteínas FBs recrutam o substrato proteico pós-traducionalmente modificado catalisando sua ubiquitinação. A Fbxo7 medeia a ubiquitinação de uma proteína reguladora do fuso mitótico, HURP (Hepatoma UpRegulated Protein) que é consequentemente degradada pelo proteassoma 26S. Ela também ubiqutitina dois reguladores da sinalização via NF- ºB, c-IAP1 (Inhibitor of Apoptosis Protein 1) e TRAF2 (TNF Receptor-Associated Factor 2), no entanto, essas proteínas não são desestabilizadas por essa modificação. Fbxo7 é considerada uma FB não usual porque ela não ubiquitina grande parte das proteínas que interagem com ela, por exemplo: reguladores do ciclo celular Cdk6 e p27 e um regulador da atividade do proteassoma PI31. Através da sua interação com p27 e Cdk6, a superexpressão de Fbxo7 aumenta o nível dos complexos ciclina D-Cdk6 e levam a transformação de fibroblastos imortalizados de forma dependente de Cdk6. Devido à capacidade de estabilizar esses reguladores das fases G1/S do ciclo celular, Fbxo7 é considerada um potencial oncogene. Além disso, a expressão exógena de Fbxo7 em células-tronco hematopoiéticas depletadas de p53 e células progenitoras promove o desenvolvimento de linfomas de células T em animais receptores dessas células. No entanto, Fbxo7 não é um gene transformante em outros tipos de células como as pro-B e pro-eritroblastos, mas ao contrário disso, tem um papel regulador negativo na sua proliferação.Foi demonstrado recentemente que mutações autossomais recessivas em Fbxo7, também chamada PARK15, causam uma atípica Doença de Parkinson (DP). Quatro mutações em PARK15/Fbxo7 foram identificadas e devido a suas localizações na proteína, foi predito que elas interferem com a atividade de E3 ubiquitina-ligase de SCFFbxo7 e previnem sua interação com seus substratos. Entretanto, os substratos descritos até hoje de Fbxo7 não estão ligados a DP. Além disso, é improvável que a regulação do ciclo celular seja um fator na DP como é a morte prematura de neurônios dopaminérgicos terminalmente diferenciados que causam a doença. Assim, existe a necessidade de identificar substratos ubiquitinados por Fbxo7 que podem explicar as causas da DP em pacientes.Nesse projeto nós propomos aplicar uma poderosa ferramenta proteômica de larga-escala conhecida como microarranjo de proteínas ou protoarray para identificar novos substratos ubiquitinados por Fbxo7. Essa ferramenta tem sido usada para identificar substratos de E3 ubiquitina-ligases purificadas através de ensaios de ubiquitinação in vitro. Dessa forma, nós poderemos identificar em um único experimento todos os potenciais alvos de Fbxo7, sem considerar variáveis como fase do ciclo celular ou tipo de célula usada que poderiam limitar o contato funcional entre Fbxo7 e seus alvos. Assim, identificaremos diretamente os alvos ubiquitinados por Fbxo7 e teremos uma visão mais sistêmica sobre a função dessa E3 ubiquitina-ligase SCFFbxo7 em câncer e Doença de Parkinson. (AU)