Utilização de microarranjos de proteínas (Protoarrays) para identificação de substratos da E3 ubiquitina ligase SCF1 (FBXO25)

Resumo

A proteína FBXO25 é uma das 70 proteínas do tipo F-box que servem como fatores de especificidade para maior família de E3 ubiquitina-ligases humanas, as do tipo RING (Really Interesting New Gene-BoX 1) oligoméricas denominadas SCF - compostas por Skp1, Cullin1, RBX1 e uma proteína tipo F-box - que estão envolvidas na ubiquitinação de proteínas para degradação via Sistema Ubiquitina Proteassoma (SUP). Menos de 10% das proteínas tipo F-box tem sua função e substratos identificados. Nós mostramos que FBXO25 acumula-se no núcleo celular formando uma nova estrutura subnuclear denominada FANDs (FBXO25 Associated Nuclear Domains) que estão envolvidos na ubiquitinação nuclear. Recentemente, reportamos a identificação de 132 possíveis ligantes de FBXO25 a partir da combinação de duas estratégias proteômicas, TAP (Tandem Affinity Purification) e YTHS (Yeast Two Hybrid System). Um desses, a proteína ²-actina globular interage via C-terminal com o N-terminal de FBXO25 e está enriquecida nos FANDs. A inibição da polimerização de ²-actina promove a desorganização dos FANDs, indicando seu papel na regulação da dinâmica desses corpos. Além disso, anticorpos anti-FBXO25 interferem na transcrição via RNA polimerase II em ensaios de transcrição in vitro. Embora tenhamos avançado nos estudos da funcionalidade de FBXO25 nenhuma das abordagens utilizadas nos permitiu a identificação direta de substratos do complexo SCFFBXO25, o que é fundamental para identificação de sua função como E3 ubiquitina-ligase. Os microarrajnos de proteínas (Protoarrays) possuem mais de 21.000 proteínas humanas imobilizadas direcionalmente em uma lâmina e vem sendo amplamente utilizados na identificação de substratos de uma classe de E3-ligases monoméricas. Não há na literatura nenhum registro do uso de Protoarrays para identificação de substratos de E3-ligases do tipo SCF, devido a dificuldade em se obter esses complexos proteicos ativos. No entanto, em ensaios preliminares de ubiquitinação in vitro sobre os Protoarrays com SCFFXBO25 purificados, obtivemos resultados extremamente promissores, com a identificação de vários alvos ubiquitinados apenas pelo complexo SCFFBXO25 selvagem. No entanto, réplicas e outros controles negativos dos experimentos são necessários para confirmação dos alvos identificados. Somos pioneiros na utilização dessa abordagem proteômica no país e dispomos de uma infra-estrutura e treinamento necessário e suficientes para sua realização. Sendo assim, o presente projeto visa identificar substratos da E3 ubiquitina-ligase SCFFBXO25 utilizando microarranjos de proteínas humanas como ferramenta proteômica.