Produção e análise funcional de células neuronais humanas geneticamente modificadas para regular a expressão da ubiquitina ligase FBXO25

Resumo

A proteína FBXO25, identificada in silico em 1999, é uma das 80 proteínas do tipo F-box (FBP) que atuam como fatores de especificidade para a família mais estudada de E3 ubiquitina-ligases humanas, as do tipo RING (Really Interesting New Gene-BoX 1) oligoméricas denominadas SCF1 - compostas por Skp1, Cullin1, RBX1 e uma FBP - que estão envolvidas na ubiquitinação de proteínas para degradação via Sistema Ubiquitina Proteassoma (SUP). A FBXO25 é capaz de formar um complexo SCF1 ativo e acumula-se no núcleo celular formando uma nova estrutura subnuclear denominada FANDs (FBXO25 Associated Nuclear Domains) que está associada à ubiquitinação nuclear. De maneira interessante, foi demonstrado que os FANDs colocalizam com agregados de proteínas poliglutaminadas (PoliGlns) característicos de diversas desordens neurodegenerativas, como a doença de Huntington e diversas ataxias espinocerebelares. Além disso, verificou-se redução na agregação das proteínas PoliGlns quando o complexo SCF1FBXO25 é superexpresso, indicando um possível papel de FBXO25 na regulação da formação desses agregados. Estudos de northern blot e RT-PCR mostraram que FBXO25 está predominantemente expressa no sistema nervoso central (SNC) e interessantemente, uma mutação no gene de FBXO25 está relacionada à desordem neural geneticamente herdada. Dessa forma, propomos para esse projeto produzir linhagens de células neuronais humanas (SH-SY5Y) que hiperexpressam de forma estável e indutível a FBXO25 e produzir linhagens de células SH-SY5Y nocaute para FBXO25. Nestas células modificadas analisaremos a viabilidade, crescimento e diferenciação celular. Também serão analisados por microarranjos de DNA genes diferencialmente regulados. É importante ressaltar que esse modelo celular será fundamental na complementação dos estudos do laboratório sobre o papel da FBXO25 na prevenção da agregação da huntintina mutante durante o desenvolvimento da doença de Huntington e na avaliação da degradação de substratos do complexo SCF1FBXO25 previamente identificados.