Aplicação de ferramentas de CRISPR/Cas9 para o desenvolvimento de uma linhagem de Saccharomyces cerevisiae capaz de produzir 4-vinil guaiacol a partir de hidrolisados de biomassa

Resumo

Compostos aromáticos representam uma fração importante do mercado mundial de aditivos alimentares e são produzidos principalmente por síntese química derivada do petróleo. Devido à crescente demanda por produtos naturais, recursos renováveis, como a biomassa lignocelulósica, apresentam-se como uma alternativa atraente para a produção de aromas. Neste sentido, o pré-tratamento físico-químico é uma etapa importante para reduzir a recalcitrância da biomassa e facilitar o processamento adicional de produção de bioprodutos a partir desta fração. A desacetilação alcalina é um pré-tratamento moderado que permite a remoção da maioria dos grupos fenólicos da biomassa lignocelulósica, incluindo o ácido ferúlico. Este ácido hidroxicinâmico, além de sua relevância industrial, desempenha um papel na formação do composto aromático 4-vinil guaiacol (4-VG), o qual tem uma ampla aplicabilidade para as indústrias de medicamentos, alimentos, perfumaria e cosméticos. Diversos microrganismos são capazes de converter o ácido ferúlico em 4-VG utilizando a enzima livre de cofator denominada descarboxilase do ácido fenólico. Diferentemente, em Saccharomyces cerevisiae, a enzima descarboxilase do ácido ferúlico (Fdc1) requer um cofator, o mononucleotídeo de flavina modificado (FMN), produzido por outra enzima, a descarboxilases do ácido fenilacrílico (Pad1). A fim de aumentar a produção de 4-VG por esta levedura, duas estratégias, independentes, foram descritas na literatura: i) a superexpressão do gene PAD1 endógeno de S. cerevisiae para um melhor balanço de cofator; ii) a expressão heteróloga da enzima livre de cofator, a descarboxilase do ácido fenólico. Neste projeto, pretendemos aplicar ferramentas baseadas no sistema de edição gênica CRISPR/Cas9 para desenvolver uma linhagem industrial de S. cerevisiae capaz de converter ácido ferúlico, derivado de hidrolisados lignocelulósicos, em 4-VG. Desse modo, o gene que codifica a descarboxilase do ácido fenólico livre de cofator da levedura lignolítica Rhodosporidium fluviale será integrado em uma cepa industrial de S. cerevisiae. Ademais, os transportadores do tipo ABC identificados no transciptoma da levedura R. fluviale serão expressos na linhagem mutante S. cerevisiae, com o objetivo de melhorar sua robustez relacionada à conversão do ácido ferúlico. O grupo de Kevin Verstrepen tem vasta experiência em modificação genética em S. cerevisiae, juntamente com uma grande coleção de leveduras usadas na indústria. Além disso, o grupo desenvolveu recentemente uma nova ferramenta de biologia sintética, usando a estratégia CRISPR/Cas9, para otimizar a expressão gênica alterando eficientemente os promotores das vias dos genes selecionados. Tal estratégia será empregada neste trabalho e apresenta extrema relevância para o desenvolvimento do projeto. (AU)