Edição dos genes CSN2 (beta-caseína) e LGB (beta-lactoglobulina) por CRISPR/Cas9 em células de Bos taurus como modelo de produção de proteínas recombinantes

Resumo

A produção e comercialização de proteínas recombinantes é um mercado multibilionário em constante expansão. Devido às limitações dos modelos de produção em bactérias e leveduras foram surgindo métodos alternativos, como os baseados em células de mamíferos. Uma das abordagens mais promissoras neste sentido é a de produzir proteínas recombinantes nas glândulas mamárias de bovinos aproveitando toda a maquinaria molecular de expressão proteica no leite desses animais e substituindo as duas principais proteínas nele presentes, a beta-caseína (CSN2) e a beta-lactoglobulina (LGB) por outras proteínas de interesse comercial. Neste contexto, a presente proposta tem como objetivo principal o knockout dos genes CSN2 e LGB em modelo bovino pela tecnologia CRISPR/Cas9. Com a nova linhagem estabelecida, pretende-se por meio do knock-in introduzir uma sequência curta não-codificante a fim de validar a técnica e como prova de conceito. Inicialmente será realizada a padronização de todas as etapas de estratégias de edição gênica (desenho dos RNAs guia, construção do donor DNA e clonagem gênica). Posteriormente, as células serão transfectadas por meio do equipamento AMAXA NucleofectorTM 2B. Após dois dias em cultura, as células serão analisadas por citometria de fluxo para avaliar a taxa de transfecção. Em seguida, será realizado o sorting das células para geração dos clones em cultura. Estes clones serão cultivados, selecionados e avaliados por meio do sequenciamento Sanger para posterior análise da frequência de indels pelo programa Synthego ICE como validação do knockout e knock-in. Esta proposta potencialmente pode gerar um novo modelo de produção de proteínas recombinantes ao permitir a introdução de transgenes de interesse comercial e terapêutico em glândula mamária bovina.