Construção de um ensaio baseado em células para detecção de anticorpos contra o receptor de acetilcolina

Resumo

A Miastenia Grave (MG) é uma doença autoimune decorrente da ação de autoanticorpos direcionados contra os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs), interferindo com a comunicação adequada entre o neurotransmissor acetilcolina (ACh) liberado pelo axônio e seu receptor nAChR, na fibra muscular. A detecção de autoanticorpos anti-nAChR tem 100% de especificidade para o diagnóstico da MG, porém as metodologias tradicionais de detecção de anti-nAChR apresentam problemas: ou tem baixíssima sensibilidade, tal como ELISA (Enzyme Linked Immunoassay) que utiliza antígenos recombinantes, ou se baseia no uso de radioisótopos, como a RIPA (RadioImmuno Precipitation Assay), de execução restrita a alguns laboratórios e com altos custos. Os objetivos consistem em desenvolver um ensaio baseado em células (CBA) para detecção de anticorpos anti-nAChRs em amostras de pacientes com MG e avaliar seu desempenho em relação às metodologias tradicionais. A pesquisa é dividida em duas etapas: 1- construção de plasmídeos vetores com os genes para as cinco subunidades do nAChR, seguido de transfecção para geração de uma linhagem celular HEK293T que expressa o receptor nAChR em sua superfície de maneira estável. Estas células serão utilizadas como substrato para uma reação de imunoflurescência indireta (IIF) usando como sonda primária a amostra do paciente com MG, este será o ensaio CBA para detecção de anti-AChR; 2- Para validação do ensaio, 100 amostras serão coletadas de pacientes diagnosticados com MG e submetidas a análise para presença de anti-AChR no ensaio CBA assim como por RIPA e ELISA. Esperamos desenvolver um ensaio para detecção de anti-AChR de execução simplificada, similar a uma reação IIF, e sensibilidade superior ao ELISA e similar ao RIPA. (AU)